哺乳動物細胞胞質RNA的分離

試劑、試劑盒 冰冷的磷酸鹽緩沖液 NaClKCl Na2HP04?7H20 KH2PO4 冰冷的裂解緩沖液： LTris-HCl NaCl MgCL2 NkmidetP-40 胎盤 RNase 抑制劑 SDS 蛋白酶 K 酚 氯 仿 異戊醇 乙酸鈉 (DEPC 處理） 無水乙醇 乙醇 乙酸鈉 DEPC處理的水

儀器、耗材 Beckman JS 4. 2 轉子或其他類似設備

實驗步驟

一 材料與設備

1) 冰冷的磷酸鹽緩沖液 (PBS):137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/l KCl,4.3 mmol/l Na2 HP04?7 H20,1.4 mmoI/L KH2PO4pH7.3

2) 冰冷的裂解緩沖液：50 mmol/LTris-HCl,pH 8.0 l00 mmoL/L NaCl,5 mmoL/L MgCL2), 0.5%(V/V)NkmidetP-40 1000 U/ml 胎盤,RNase 抑制劑 (如：RNasin) 及 1 mmol/LDTT，用 DEPC 處理的水配制，過濾除菌

3)20%SDS

4)20 mg/ml 蛋白酶 K

5) 酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1)

6)3mol/L 乙酸鈉 (DEPC 處理）pH 5.2

7) 無水乙醇

8)75% 乙醇/25%0.lmoL/L 乙酸鈉，pH 5.2

9)DEPC 處理的水

二 操作方法

1) 收集細胞：①對于貼壁細胞，每 10 cm 的培養皿用 Iml 冰冷的 PBS 洗三次，再以小體積的 PBS 刮下細胞并轉移到離心管中 (置于冰丄）300 g 離心 5 min 去上淸，冰上放置。

②對于懸浮細胞，以 300 g 離心 5 min 收集細胞，去上清。再用一半體積冰冷的 PBS重懸細胞，按前述方法離心并去上清。

2) 以 375ul 冰冷的裂解緩沖液重懸細胞，冰上孵 5 min。在_4℃ 用微型離心機離心2 min 上清轉移至一裝有 4ul20%SDS 的管中,立即振蕩混勻。

3）加人 2.5ul20 mg/ml 的蛋白酶 K,37℃ 溫育 5 min

4) 加人 400ul 酚：氯仿：異戊醇，振搖 Imin。離心，上層水相轉移至一干凈管中，重復抽提一次，再用 400ul 氯仿：異戊醇抽提一次. 上: 層水相轉移至一干凈管中。

5) 加人 40ul3mol/l 乙酸鈉 (pH5.2) 和 lml 無水乙醇, 混合，冰上沉淀;15?30 min 或一 20℃ 沉淀過夜。

6) 于 4℃ 以 1200 g 離心 15 min。再用 1 ml75% 乙醇/25?0.lmol/1 乙酸鈉(PH5.2) 洗滌沉淀。干燥后溶于 100ulDEPC 水中。取出一小份測定其濃度及純度，其余負 70℃ 保存

注意事項

1 ) 此方法一次可處理 2 X107 個細胞，每 107 個細胞可獲得 30?100ug  RNA 。其 A260/080 應該在 1. 7?2 . 0 之間。

2 ) 第二步操作重懸細胞時要小心操作，避免起泡沫,, 待懸液迅速變清，則顯示細胞裂解完成

3 ) 如果所收集的細胞轉染過 DNA，可用無 RNase 的 DNase  I  消化去掉污染的DNA , 再按前述的方法用酚：氯仿：異戊醇及氯仿：異戊醇抽提回收 RNA 。