哺乳動物細胞的RNAi技術策略(1)

目前RNAi技術已經進入了生物科學研究的許多領域，成為了一種主要的生物學研究工具，發展得相當迅速，并受到了此次諾貝爾獎評審委員會的青睞，獲得2006年諾貝爾獎醫學/生理獎。然而這一才歷經十個年頭的技術依然對于許多研究人員來說還是很陌生的，以下是有關 i技術在哺乳動物細胞中應用的具體設計策略，主要來自于《遺傳》雜志2005年“ 干涉（i）技術應用于哺乳動物細胞的研究策略”，希望能給從事或者準備從事 i相關實驗的研究人員以幫助。
一、靶si 序列選擇
靶si A序列選擇是 i實驗成敗的關鍵。哺乳動物細胞 i實驗中，使用最廣泛且最有效的是21bp si 。si 由正義鏈和反義鏈組成，兩條鏈3’端均有2個堿基突出，一般為UU或dTdT，其中正義鏈的前19nt與靶基因序列相同。
1. si 設計的原則
Si 雙鏈設計時，一般在靶m 起始密碼下游100―200bp至翻譯終止密碼上游d0―100bp的范圍內搜尋AA序列，并記錄每個AA3’端相鄰19個核苷酸作為候選si. 靶位點。其中AA（N19）TT是最理想的序列，若靶m 中無此序列，亦可選用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成時，si 的正義鏈3’端需用dT―dT代替。TuscRl等建議設計的si 不要針對m 的5’和3’端非編碼區，因為這些區域有豐富的調控蛋白結合位點，而UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP（si protein complex，核酸內切酶復合物）結合m ，從而影響si 干擾的效果。最后還應將候選si 序列在GenBank進行BLAST檢索，與非同源基因具有3個或3個以上堿基相異的序列方可選用。
2. 高效si 的序列結構特征
除了靶序列位點的選擇，siI 序列本身結構特征亦會影響到 i效率。 i實質上可視為一個與蛋白質互作過程，包括si 與RISC結合、RISC的激活以及RISC與靶m 的結合和切割，這種互作效應的存在，往往造成si 鏈的選擇具有偏愛性。Reynolds等通過對2個基因的180條si 序列分析，歸納出以下8個與
si 高效性相關的特征:G/C含量低(30%-52%)，正義鏈3’端具較低穩定性（有利于si 與RISC的結合和解鏈），無反向重復序列（有利于減小si 的有效作用濃度，提高si 干擾效率），正義鏈堿基的偏愛性A19（正義鏈中第19位堿基為A，如下表示類同）；A3；U10；無G/C(正義鏈中第19位堿基不為G或C)；無 G13。依此規則，Reynolds等設計的30條si 中有29條是有效的。Kumiko等亦認為si 反義鏈5’端為A/U（即有義鏈U/A）19和最后7個堿基中有5個A/U，會有助于 i的高效發揮，且正義鏈G/C1和序列中無連續9nt以上的GC重復片段與基因沉默效率呈顯著相關。有趣的是，該實驗還表明這些規則同樣適用于DNA介導的 i（DNA-based i.）實驗。此外，Amarzguioui等發現正義鏈5’與3’端的前3個堿基中A/U含量不對稱(3’端含量應高一些)和A6對si 的活性亦影響很大。根據上述結果，可以初步繪制出一個高效si 序列結構的精細與簡略示意圖。

現已知道si 的反義鏈決定著靶位點識別，那么在不影響si 作用功效的前提下，是否可以對其正義鏈堿基作適當更改或修飾呢？Amarzguioui等研究si 不同部位對堿基突變和化學修飾的耐受性，認為si 的5’端相對于3’端具有對突變的較高耐受性。有學者認為正義鏈3’突出端的任何堿基修飾對si 作用效果均無明顯影響。還有學者認為與反義鏈互補的正義鏈3’端發生1―4個堿基的錯配反而有助于增強 I的活性。
二、si 制備方法
目前為止較為常用的5種制備si s的方法包括
化學合成
體外轉錄
長片斷ds s經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
si 表達載體或者病毒載體在細胞中表達si s
PCR制備的si 表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備si s然后經過轉染或者電轉導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達si s的DNA載體或者表達框轉染到細胞中。每種方法都有自己的優點和缺點。哪種是最好的方法，其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法，優點和缺點，以及它們最適合的應用。
si 的設計
除了方法3以外，其他的方法都在制備si 前都需要單獨設計si 序列。關于怎樣設計si 以及si 設計對si 功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說，每個目標序列設計3―4對si s，在后面的實驗中選擇最有效的那個。網上有提供免費的si 設計工具。
體外制備