5. si 表達框架
si 表達框架(si expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的si
表達模版，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。這個方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一個 pol
III啟動子，一段發夾結構si ，一個 pol III終止位點。和si
表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選si
的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和si 的最適搭配！如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的si
后，可以直接克隆到載體中構建si 表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達si 和長效抑制的研究。
這個方法的主要缺點是PCR產物很難轉染到細胞中。如果有適合的新型轉染試劑能提高SEC的轉染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規模制備。
Silencer Express si Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6啟動子或者人源H1啟動子元件可供選擇，并已經過c-fos基因抑制的檢驗。
最適用于：篩選si 序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子
不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）
三、si 的轉染
將si 、si 表達載體或SECs導入哺乳動物細胞中是誘導
I發生的關鍵。有許多轉染試劑可供選用，最常用的是脂質體轉染試劑。某些情況下電穿孔法亦可用，但易導致較高的細胞毒性反應。對于同一細胞系，使用不同的轉染試劑或方法，其效率往往會有所不同；而對于不同的細胞系，使用同一種轉染試劑或方法，效果亦會不同。因此在實驗過程中，有必要嘗試多種試劑或方法來確定最優條件。轉染效率可通過測定細胞的密度，轉染的時間和si
與轉染試劑的比例來評價。
四、實驗對照設置
實驗對照是衡量 i.實驗數據可信度的一個重要因素。設立陽性對照目的是通過檢測不同濃度的si
轉染效率及其最終干擾效果，來確定合適的轉染條件和最低有效的SI 濃度。有實驗表明RISC復合物具有飽和性，且過多si
會導致細胞毒性和死亡。對于大多數細胞，持家基因（如GAPDH，c-cmyc, β―acion等）是較好的陽性對照，針對這些基因的高效SI
序列已有報道。陰性對照是用來檢測 i的特異性。通常作為陰性對照的si 與選中的si 序列有相同堿基組成，但與靶m 無明顯同源性。陰性對照的si
序列設計有2種方法，一是將特異性si 的序列打亂，即“零亂”si （scrambled si
），再對其進行BLAST比對，防止與目的靶細胞中的其他基因有同源性；另一種是在特異性si
中引入幾個錯配堿基。若引入的是一個堿基錯配，應需考慮它與突變m (即SNP位點)結合能力，最好在設計si 時就避免SNP區。
五、i效果檢測
i效果可從m 和蛋白質兩個水平來進行量化。在m 水平上，Northern
Blot和實時定量PCR是兩種常用方法。值得注意的是在進行實時定量PCR時，cDNA合成要用oligo(dT)，而不是隨機引物，且預擴增片段最好位于靶m
序列中si 位點的上游。蛋白質水平可以通過Western Blot、熒光免疫檢驗法、流式細胞分析術和表型分析來檢測。
i一般在轉染后24小時內發生，其引發基因沉默的程度和持續時間依賴于靶蛋白質的降解率(turnover rate of the
protein)、si 在細胞內的壽命以及其逐漸被稀釋的程度。