本法系用酸水解方法將結合狀態的唾液酸變成游離狀態,游離狀態的唾液酸與間苯二酚反應生成有色化合物,再用有機酸萃取后,測定唾液酸含量。
唾液酸對照品溶液(200μg/ml)的制備 精密稱取唾液酸對照品10.52mg(1μg唾液酸相當于3.24nmol),置10ml量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,混勻,即為唾液酸貯備液(1mg/ml),按一次使用量分裝,-70℃貯存,有效期1年。僅可凍融1次。4℃保存,使用期為2周。精密量取唾液酸貯備液1ml,置5ml量瓶中,加水至刻度,即為每1ml含200μg的唾液酸對照品溶液,用前配制。
用于C群腦膜炎球菌多糖疫苗唾液酸含量測定時,同法制備濃度為400μg/ml的唾液酸對照品溶液貯備液(精密稱取唾液酸40mg,置100ml量瓶中,用純化水溶解并定容至刻度,混勻,即得)。精密量取唾液酸貯備液2.0ml,置10ml量瓶中,加水至刻度,即為每1ml含80μg的唾液酸對照品溶液,用前配制。
測定法 取供試品適量,加水稀釋至蛋白質濃度為每1ml含0.2～0.4mg,作為供試品溶液。按下表取唾液酸對照品溶液、水及供試品溶液于10ml玻璃試管中,混勻,每管再加入間苯二酚-鹽酸溶液(分別量取2%間苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/L硫酸銅溶液62.5μl、25%鹽酸溶液20ml,加水稀釋至25ml,混勻。試驗前4小時內配制)1ml,加蓋,沸水煮沸30分鐘(水浴面高于液面約2cm),取出置冰浴中3分鐘(同時振搖)后,每管加乙酸丁酯-丁醇溶液(取4體積乙酸丁酯與1體積丁醇混勻,室溫下保存,12小時內使用)2ml,充分混勻,室溫放置10分鐘,照紫外-可見分光光度法(通則0401),在波長580nm處測定吸光度。
腦膜炎球菌疫苗唾液酸含量測定:取含唾液酸約40μg/ml的供試品溶液和純水對照各2ml;另分別取唾液酸對照品(80μg/ml)0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml于各管中,補水至2.0ml為標準曲線各點。各管加2ml顯色劑(0.1mol/L硫酸銅溶液0.5ml、4%間苯二酚溶液5ml、濃鹽酸80ml,補水至100ml混勻。臨用現配)搖勻,沸水浴15分鐘后冰浴5～10分鐘,每管加4ml有機相(正丁醇15ml,加乙酸丁酯定容至100ml),充分搖勻后置室溫10分鐘。以純水對照為0點,于585nm測定吸光度,并作直線回歸。(可按比例縮小供試品及各試劑體積)
以唾液酸對照品溶液的濃度對其相應的吸光度作直線回歸(相關系數應不低于0.99),由直線回歸方程計算5μg唾液酸的吸光度值,再按下式計算供試品唾液酸含量。
式中 A1為5μg唾液酸的吸光度;
A2為供試品的吸光度;
n為供試品稀釋倍數;
P為供試品蛋白質含量,μg/μl;
W為1nmol促紅素的量(不包括糖成分量),相當于30.6μg。
腦膜炎球菌多糖疫苗供試品唾液酸含量(μg/ml)=A×n
式中 A為供試品溶液吸光度相對于唾液酸對照品溶液的濃度,μg/ml;
n為供試品的稀釋倍數。