噬菌體抗體庫的富集篩選

實驗概要

用于噬菌體抗體庫富集篩選的抗原至關重要，一般來說，純化后的可溶性蛋白純度高，含量大，可直接包被ELISA板，是篩選特異性抗體的最佳選擇。在某種情況下，需要獲得針對某一特殊蛋白的單克隆抗體，也可以用抗這種蛋白的單克隆抗體捕捉抗原的方法來進行篩選。

實驗步驟

1. 將用于篩選特異性抗體的抗原用0.1mol/L pH值8.6碳酸鈉碳酸氫鈉溶液做一定量稀釋后包被96孔板，一般抗原濃度要求至少25μg/ml，每孔50~60μl，4℃過夜。

2. 次日洗去板中未吸附的抗原，用3% BSAPBS或用4%~5%脫脂奶粉PBS于37℃封閉1h 。

3. 棄封閉液，在每孔加入50~70μl噬菌體抗體庫，37℃孵育2h。

4. 棄孔中未結合噬菌體，用TBS/Tween 20(pH值7.5的50mmol/L TrisHCl，150mmol/L氯化鈉，0.5% Tween 20)洗液洗每一孔，共洗10~20次，充分洗去非特異性吸附噬菌體。每一次清洗時，可用帶有吸頭的移液器反復吹打每孔，但是切勿過度。

5. 用蒸餾水洗兩次，將每孔中的液體吸干凈。

6. 每孔加入pH值2.2的甘氨酸鹽酸洗脫緩沖液50μl，室溫孵育10min，期間用移液器吸頭反復吹打幾次，但注意勿吹出過多氣泡。

7. 加入3~5μl 2mol/L Tris，使溶液的pH值在7.0左右，以中和洗脫下來的噬菌體溶液。

8. 立即加入2ml新鮮制備的OD₆₀₀=1左右的Ecoli XLIBlu菌，室溫孵育15~20min。

9. 轉入一200ml三角瓶中，加入10ml SBA T (SB培養基，20μg/ml氨芐青霉素，10μg/ml四環素)立即取10μl、1μl和01μl涂LB氨芐平皿以滴定洗脫下來的噬菌體，其余部分轉入三角瓶，于37℃振蕩培養1h。

10. 加入100ml SBA T (SB培養基，50~100μg/ml氨芐青霉素，10μg/ml四環素)，37℃ 1h。

11. 加入1012pfu的輔助噬菌體VCSM13，37℃ 2h。

12. 加入卡那霉素70μg/ml，37℃振蕩培養過夜。

13. 重復以上富積篩選步驟，至少如此重復三輪至四輪。

14. 經三輪富集篩選后，將洗脫下來的噬菌體感染新鮮制備的XLIBlu菌，37℃過夜培養后，保存長有單個菌落的平皿于4℃待用。