噬菌體DNA從噬菌斑到濾膜的轉移實驗

λ 噬菌體文庫大腸桿菌鋪平板細菌

變性液中和液SM+ 明膠SSPE

LB 或 NZCYM 瓊脂平板LB 或 NZCYM 頂層瓊脂糖交聯設備微波爐或真空爐注射針和注射器硝酸纖維素膜或尼龍膜水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

變性液

中和液

SM+ 明膠

2X SSPE

2. 培養基

LB 或 NZCYM 瓊脂平板

LB 或 NZCYM 頂層瓊脂糖

3. 專用設備

交聯設備（如 Stratgene 公司的 Stratalinker、Bio-Rad 公司的 GS gene Linker)、

微波爐或預置于 80℃ 的真空爐

注射針和注射器（21 號）

硝酸纖維素膜或尼龍膜

預置于 47℃ 和 65℃ 的水浴

防水的黑繪圖墨（印度墨）

Whatman 3 MM 紙

Whatman 3 MM 濾紙（直徑為 85 mm)

4. 載體和菌株

λ 噬菌體文庫

大腸桿菌鋪平板細菌

二、方法

濾膜的制備和噬菌斑的轉印

1. 轉印濾膜的制備：

(1) 用軟鉛筆或圓珠筆對干濾膜編號。

(2) 將濾膜在水中浸泡 2 min。

(3) 將濾膜疊放在一起，兩張濾膜間用直徑為 85 mm 的 Whatman 3 MM 濾紙隔開。

(4) 將這一摞濾膜用鋁箔包起來，于蒸汽鍋（liquild cycle)中 15 psi (1.05 kg/cm²) 高壓滅菌 15 min。

2. 將包裝混合物、噬菌體原種或文庫用 SM+ 明膠進行稀釋。將稀釋的噬菌體原種與適當量新鮮制備的鋪平板細菌混合。感染細菌培養物 37℃ 溫育 20 min。



3. 在每份感染細胞中加入 3 ml 或 6.5 ml 熔化的（47℃）頂層瓊脂，混勻，倒入獨立編號的 90 mm 或 150 mm 瓊脂平板中。

4. 蓋上平板，使頂層瓊脂糖凝固，37℃ 倒置培養，直到噬菌斑出現，并剛剛開始相互接觸（10~12 h)。

5. 將平板于 4℃ 至少放置 1 h, 使頂層瓊脂糖凝固。

6. 將平板從冷庫或冰箱中取出。用第一套標記濾膜影印每個平板的噬菌斑。將標記的干燥、圓形硝酸纖維素膜或尼龍膜放在頂層瓊脂糖的表面，使其與噬菌斑直接接觸。

7. 在濾膜的四周標記三個或更多個點，用 21 號注射針刺穿這幾個點直至下面的瓊脂，注入防水的黑繪圖墨。

8. 1~2 min 后，用一個平端鑷子（如 Milhpore 鑷子）依次從每個平板上揭下濾膜。

噬菌體 DNA 在濾膜上的變性

9. 在自助食堂塑料盤中或 Pyrex 平皿中放入一張浸滿變性液的 Whatman 3 MM 濾紙 ( 或相當型號），然后將濾膜轉移至濾紙上，有噬菌斑的一面朝上，放置 1~5 min。

10. 將濾膜轉移至浸滿中和液的 Whatman 3 MM 濾紙上，有噬菌斑的一面朝上，放置 5 min。

將噬菌體 DNA 固定在濾膜上

11. 制備用于固定的濾膜。

通過微波或烘烤將 DNA 固定在濾膜上：若用微波爐，則直接按步驟 13 進行； 若在真空爐內烘烤，則將濾膜轉移至一張 3 MM 的干濾紙上或一摞紙巾上。在室溫濾膜至少干燥 30 min。

通過紫外交聯將 DNA 固定在濾膜上：將濾膜置于一張浸泡了 2X SSPE 的 Whatman 3 MM 濾紙上，然后放在紫外交聯儀的附近。

12. 如果需要，在第一套濾膜處理完后，用第二套濾膜進行噬菌斑影印。保證兩套濾膜以相同位置放入平板。

13. 將 DNA 從噬菌斑固定至濾膜上

通過微波爐處理進行固定：將濕濾膜放在一張干 Whatman 3 MM 濾紙上，微波爐內以最大功率照射 2~3 min。

通過烘烤固定：將干濾膜（步驟 10）摞成一疊，兩張濾膜間用干 Whatman 3 MM 濾紙隔開，在真空爐中 80℃ 烘烤 1 ~2 h。

通過紫外交聯固定：用市售設備完成該項操作，按照廠家說明書進行。

14. 烘烤或交聯后，將干濾膜用鋁箔寬松地包起來，保存于室溫。另外，若雜交在大約一天內進行，用 0.1X SSC 或 SSPE 和 0.5% SDS 65℃ 洗膜 30 min，濕潤保存于封口塑料袋中。