四唑鹽（MTT）比色實驗——MTT法

活細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在490  nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。 

細胞

D-Hanks液牛血清RPMI1640雙抗0.08%胰酶

凈化工作臺離心機恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養箱吸管玻璃瓶培養瓶廢液缸吸頭槍頭膠塞離心管量加樣槍紅血球計數板

一、接種細胞

1.  用0.08%胰蛋白酶消化單層培養細胞。

2.  用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液配成單個細胞懸液。

3.  以每孔10³～10⁴個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200 ul。

二、培養細胞

1.  將培養板移入CO₂孵箱中。

2.  在37℃、5% CO₂及飽和濕度條件下培養。（培養時間取決于實驗目的和要求）

三、呈色

1.  每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 ul，37℃孵箱中繼續孵育4 h。

2.  終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。

3.  對于懸浮生長的細胞，需離心（1000 rpm，5 min），然后棄去孔內培養液。

4.  每孔加入150 ul DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。

四、比色

1.  選擇490 nm 波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

2.  以時間為橫軸，光吸收值為終軸繪制細胞生長曲線。

1.  選擇適當的細胞接種濃度。在進行MTT試驗前，對每一種細胞都應測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，然后確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間。

2.  避免血清干擾，一般選小于10%胎牛血清的培養液進行試驗。

3.  設空白對照，與試驗平行設不加細胞只加培養液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調零。