四唑鹽（MTT）比色實驗

活細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在490  nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。 

細胞

D-Hanks液 牛血清 RPMI1640 雙抗 0.08%胰酶

凈化工作臺 離心機 恒溫水浴箱 冰箱 倒置相差顯微鏡 培養箱 吸管 玻璃瓶 培養瓶 廢液缸 吸頭 槍頭 膠塞 離心管 量加樣槍 紅血球計數板

一、接種細胞

1.  用0.08%胰蛋白酶消化單層培養細胞。

2.  用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液配成單個細胞懸液。

3.  以每孔10³～10⁴個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200 ul。

二、培養細胞

1.  將培養板移入CO₂孵箱中。

2.  在37℃、5% CO₂及飽和濕度條件下培養。（培養時間取決于實驗目的和要求）

三、呈色

1.  每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 ul，37℃孵箱中繼續孵育4 h。

2.  終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。

3.  對于懸浮生長的細胞，需離心（1000 rpm，5 min），然后棄去孔內培養液。

4.  每孔加入150 ul DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。

四、比色

1.  選擇490 nm 波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

2.  以時間為橫軸，光吸收值為終軸繪制細胞生長曲線。

1.  選擇適當的細胞接種濃度。在進行MTT試驗前，對每一種細胞都應測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，然后確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間。

2.  避免血清干擾，一般選小于10%胎牛血清的培養液進行試驗。

3.  設空白對照，與試驗平行設不加細胞只加培養液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調零。