四環素的定向發酵

一、目的和要求
　　1、通過實驗加深對定向發酵的理解。
　　2、學習利用沉淀或溶媒法提取四環類抗生素的操作技術。

二、原理
　　金霉素在化學結構上與四環素十分相似，區別僅在C-7位上，以Cl取代了H。所以，金霉素又稱為7-氯四環素。金霉素鏈霉菌是金霉素的產生菌，但當培養基中存在抑氯物質時，由于氯的摻入受阻，而使得金霉素鏈霉菌的生物合成方向發生變化，并使四環素成為主要產物。

　　本實驗以M-促進劑（硫醇苯駢噻唑）作為氯化霉的抑制劑，以溴化鈉作為競爭性抑制劑進行四環素的定向發酵。四環素是兩性化合物，通常可以采用沉淀法、溶媒萃取法或離子交換法進行提取。本實驗采用了前2種方法，它們的分離主要是利用了四環素既可以與酸、堿反應，同時又可以與某些金屬離子形成鹽類，及其在不同溶劑、不同pH值時溶解度不同的特性，進行反復萃取，最后通過精制結晶和洗滌而獲得成品。

三、實驗材料
　　1、菌種：金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）
　　2、培養基：斜面菌種用麥仁培養基，300ml三角瓶中分裝25ml四環素種子培養基，500ml三角瓶中分裝50ml發酵培養基，共4種。
　　3、四環素發酵液（發酵液效價≥10,000u/ml）。
　　4、化學試劑：草酸，EDTA  混合試劑，2mol/L HCl，黃血鹽，ZnSO4，2mol/L HCl，11% HCl，20% HCl，MgCl2，CaCl2，20%乙醇溶液，氨水，Na2CO3/NaOH
　　（1：1）混合堿，20% NaOH，pH分別為2、4.5的酸水，4% HCl/正丁醇（1：10），丙酮。
　　5、滅菌物品：10ml破口吸管。
　　6、其它：接種用具，50ml、100ml、500ml三角瓶，50ml、100ml、500ml燒杯，滴管，50ml容量瓶，100ml量筒，50ml離心管，玻璃漏斗，濾紙，玻璃棒，精密pH試紙，水浴鍋，搖床，剪刀，天平，布氏漏斗，結晶皿，稱量瓶，藥勺，真空泵，抽濾

四、實驗實施
　　1、制備斜面孢子：將活化的金霉素鏈霉菌接入麥仁培養基斜面，35～37℃培養5天。
　　2、制備種子：將約1cm2的麥仁孢子接入25ml四環素種子培養基中，200r/min、28℃下振蕩培養20h，擴繁1次。
　　3、發酵：以破口吸管取2.5ml種子液接入50ml發酵培養基中，200r/min、28℃下振蕩培養5天。
　　4、四環素的沉淀提取