四環素控制系統誘導基因表達實驗——pTettTAK穩定轉染2

tTA 是一種融合蛋白，它是由來自于大腸桿菌的四環素抑制蛋白和皰疹病毒的 VP16 蛋白的轉錄激活區域組成的。在缺乏四環素時，tTA 就結合到并激活位于基因前端的由 Tn10 和一個小的 CMV 啟動子組成的七聚體結構的四環素抗性控制子（簡稱 Tet P）。

當 tTA 結合到 Tet P 后，有四環素存在時，后續的基因就會失活。質粒 pTet-Splice 含有 Tet P 上游、SV40 剪切序列、多聚 A 信號下游及一個多克隆位點，在此編碼所選擇的目的基因可讀框的序列可以很容易地插入。自主調控的 tTA 的表達是由質粒 pTet-tTAK 啟動的，這個質粒中的 tTA 可讀框（含有優化的翻譯起始序列，Kozak 序列）已插入到質粒 pTet-Splice。

這個方法介紹用 pTet-tTAK 穩定轉染貼壁細胞，以產生表達可誘導 tTA 的細胞系。

第一輪轉染后，可產生僅僅表達可誘導 tTA 的穩定細胞系。也可以用此方案進行 pTet-tTAK 和表達靶基因的質粒穩定共轉染。第二輪轉染是用表達靶基因的質粒轉染表達可誘導 tTA 的穩定細胞系。

NIH3T3 細胞質粒

完全的 DMEM-10 培養基完全的 DMEM／tet選擇培養基CaCl2HEPES 緩沖鹽（HeBS）氯喹甘油嘌呤霉素PBS1 × 胰酶／EDTA

10 cm 和 6 cm 組織培養皿4 ml 聚苯乙烯管24 孔和 6 孔組織培養皿

實驗前準備詳見「其他」。

1. 用選擇培養基（500 μmol/L L-組氨醇）培養可誘導表達 tTA 的穩定細胞系。轉染前 1 天，用選擇培養基（500 μmol/L L-組氨醇）接種適量的細胞于 10 cm 組織培養皿中，使在轉染時細胞生長至 1/3 匯片。

2. 轉染之前使質粒線性化，調節質粒濃度>0.5 mg/ml。

3. 用 500 μl HeBS 在干凈的 4 ml 聚苯乙烯管混合 10~20 μg 每一目的基因質粒和 1~2 μg pPGKPuro （每一 tet 質粒與帶選擇標記質粒的摩爾數比例為 10:1）。

設立無 DNA的轉染對照。在嘌呤霉素存在下（步驟 14） 所有的細胞都應死亡。嘌呤霉素（最低劑量內 0.1~10 μg/ml，這一劑量能夠在幾天內殺死所有沒有轉染的細胞）最佳的致死濃度應在 轉染之前根據不同的細胞類型加以確定。

4. 向質粒 DNA 中加入 32.5 μl 2 mol/L 的 CaCl₂，立即輕輕振蕩混勻。間歇輕輕振蕩，在室溫放置 15~30 min 讓沉淀生成，或直至與裝水的管相比有明顯混濁。

5. 將培養基從細胞中吸出，一次做一個板子。用巴斯德槍頭抽吸幾次混勻沉淀，逐滴均勻地覆蓋所有細胞。

6. 溫育 30 min，15 min 后輕輕振搖平板，以確保均勻覆蓋整個板子。

7. 向每個平板中加入 10 ml 含 500 μmol/L L-組氨醇的選擇培養基，含或不含 25 μmol/L 氯喹（終濃度）。

8. 溫育 4~5 h。

9. 輕輕地將培養基吸出，盡量不要觸及位于細胞上的沉淀。逐滴加入 2.5 ml 預熱的 85% HeBS/15% 甘油，休克處理細胞。

在甘油休克處理細胞前，特別是休克處理后看到細胞碎片是正常的現象。根據研究者操作的速度，可以同時休克處理 2~4 塊板子。

10. 2.5 min 后將 HeBS/甘油吸出。快速操作，因為甘油對細胞的毒性很大。

根據不同的細胞類型，細胞暴露在甘油溶液中的時間長短是可以調節的，可以延長到 4~5 min 以得到最佳的轉染效率。在導致最少細胞死亡的情況下應休克處理更長的時間。

11. 輕輕地、快速地清洗細胞 2 次，每次加入 500 μmol/L L-組氨醇的選擇培養基，然后立即吸出。

將所有的培養基加到培養皿中的一個點上，以防培養皿中的細胞脫落。

12. 加入 10 ml 的 500 μmol/L L-組氨醇的選擇培養基，溫育過夜。

13. 轉染后的第 2 天早上，吸出培養基，加入 10 ml 含 500 μmol/L L-組氨醇的選擇培養基，繼續溫育。

14. 轉染后 48 h，用含 3 μg/ml 嘌呤霉素（終濃度）和 500 μmol/L L-組 氨醇的選擇培養基按上述的方法對細胞進行稀釋。

嘌呤霉素（最低劑量為 0. 1~10 μg/ml，這一劑量能夠在幾天內殺死所有沒有轉染的細胞）最佳 的致死濃度應作轉染之前根據不同的細胞類型加以確定。3 μg/ml 的嘌呤霉素對于篩選轉染的 NIH3T3 細胞足足夠的。

15.僅對第二輪：4 天后，用含 500 μmol/L L-組氨醇/嘌呤霉素的選擇培養基培養細胞。

16. 當克隆形成完好（選擇 12~14 天），環繞克隆四周做個標記。從培養皿中吸出培養基，將一個塑料克隆環環繞單獨克隆放置。用 100 μl PBS 快速沖洗克隆，加 2 滴胰酶（100 μl） 處理 30 s~1 min。

從培養皿中挑選細胞，單獨的克隆適度地分布于培養皿上很容易區分。

17. 同第一輪處理，將其轉移到 1 ml 含 500 μmol/L L-組氨醇/嘌呤霉素的選擇培養基中。

18. 當細胞長滿時，用含 500 μmol/L L-組氨醇/嘌呤霉素的選擇培養基 將細胞轉移至 6 cm 的組織培養板中。

所有的胰酶消化均按照標準的方法進行，包括快速的 PBS 清洗，1~3 min 的胰酶/ EDTA 溫育（每個生長至匯片的 10 cm 的培養板用 2 ml） 和用含 10% 牛血清的 500 μmol/L L-組 氨醇選擇培養基（+/- 嘌呤霉素）稀釋終止胰酶消化反應。

19. 經過誘導后通過 Northern 或免疫印跡檢測目的基因的表達。將分裝的細胞凍存于液氮中。此后細胞用含 500 μmol/L L-組氨醇/嘌呤霉素的選擇培養基進行培養。

1. 所有的組織培養都在加濕的 5% CO₂ 培養箱中 37℃ 培養。

2. 每次轉染需要一個培養皿。一個典型的實驗應該包括 tTA 對照培養皿、tTA 和靶基因對照培養皿，以及非轉染對照培養皿。

完全的 DMEM/tet：

完全的 DMEM-10 培養基，包括 0.5 μg/ml 鹽酸四環素（Sigma；在 70% 的乙醇中稀釋 10 mg/ml 儲備，避光在 -20℃ 條件下保存）

選擇培養基含 125 μmol/L、250 μmol/L 或 500 μmol/L L-組氨醇

第一輪或共轉染所需的質粒：

pTet-tTAK (Life Technology) 和含 IE 基因可讀框的質粒，靶基因克隆到 pTet-Splice (Life Technology)， PSV2-His 或其他有選擇標記的質粒；經過 CsCl 或陰離子交換層析法純化。

第二輪轉染所需的質粒：

含靶基因可讀框的質粒，靶基因克隆到 pTet-Splice (Life Technology)、pPGKPuro 或其他有選擇標記的質粒；經過 CsCl 或陰離子交換層析法純化

2mol/L CaCl₂

10 mg/ml 氯喹（19 mmol/L，選用，Sigma）; 用水稀釋，在-20℃ 保存

85% HeBS/15% 甘油 37℃ 預保溫

3 mg/ml 嘌呤霉素（Sigma） 用 PBS 稀釋