固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗14

包含蛋白質樣品的凝膠

轉移緩沖液

印跡紙硝化纖維素薄膜或 PVDF 膜電源電泳轉移設備

1.測量 SDS-PAGE 凝膠的尺寸，將轉移膜剪成與凝膠相適應的尺寸。

槽式轉移系統的膜根據需要可以剪成比凝膠大或者小。

2.用水將薄膜潤濕或用甲醇將 PVDF 膜潤濕。操作要小心，以避免膜不平整及膜下面產生氣泡。

3.將濕潤的薄膜轉移到一個盛有轉移緩沖液的平皿中，使膜在其中平衡 5 min。

4.將印跡紙剪切成合適大小，按照轉移設備的指導手冊進行操作。

5.將印跡紙、凝膠和膜排列成「三明治」狀，避免在任何層之間產生氣泡。這是很關鍵的，因為氣泡可阻止相關位置蛋白質的轉移。最好按以下（1）~（8）的說明進行操作：

（1）將轉移盒放人盛有轉移緩沖液的平皿中。

（2）將泡沫海綿放在轉移盒里，擠壓走所有氣泡。

（3）將印跡紙的一層放在海綿的上面，以保證其完全濕潤和平整；在印跡紙上來回滾動玻璃棒以趕走氣泡。

（4）將雙向凝膠放在印跡紙表面，排列整齊，通過滾動的玻璃棒趕走所有的氣泡，但要小心不要在凝膠上施加太多的壓力。

（5）將轉移膜放在凝膠上方，注意一開始應將膜放在準確的位置，在凝膠上移動膜通可能引起污跡；用滾動的玻璃棒去除膜與凝膠之間的氣泡。

（6）將另外一張印跡紙放在膜上，確保它濕潤、平整；通過滾動玻璃棒去除印跡紙表面的氣泡。

（7）將泡沫海綿放在轉移盒中，擠壓走海綿中的氣泡。

（8）蓋上轉移盒的蓋子。

6.對其他每塊要進行電泳轉移的凝膠重復步驟5。

7.在轉移盒中裝人 2/3 體積的轉移緩沖液。

8.將轉移盒放入轉移槽中。

實驗提示：確保線路連接正確以便使蛋白質從凝膠轉移到膜上，而不是從凝膠到印跡紙，最后到溶液中。

9.在轉移單元中加轉移緩沖液以確保所有的轉移盒浸沒在緩沖液中。

10.將蓋子放在轉移槽上，使正極（紅）接近于膜而不是凝膠。

使在電泳期間，使凝膠上的蛋白質從負極（黑）遷移到正極（紅）。

11.如果轉移進行 lh，將循環水浴和熱交換系統相連，溫度設置在 15°C。

這種轉移設備在高電流條件下使用，如沒有有效的冷卻設備，將會損壞轉移設備。循環水浴將能保持轉移過程中的溫度。

12.按照操作指導手冊建議的時間和電流進行轉移。

13.當完成轉移時，停止水浴，關掉電源。打開蓋子，移出轉移盒。

14.卸下轉移盒里的海綿、印跡紙、膜、凝膠。用去離子水洗凈海綿，在空氣中瞭干以備下一次使用。用軟鉛筆來標記對著凝膠的膜面的一邊。

不要用鋼筆或記號筆，因為墨水會溶解在浸膜所用的緩沖液中。

15.對膜進行染色或處理印跡（參見方案 17~20)，或將膜置于印跡紙之間，于黑暗處干燥保存。

如果干燥保存，在染色之前，必須用水（硝酸纖維素薄膜）或甲醇 (PVDF 膜）重新濕潤。