固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗3

細菌裂解液含大量核酸，在進行雙向凝膠電泳之前，需先對核酸進行處理。可通過超聲波處理包含脲和 CHAPS 的細菌提取液。當脲存在時，核酸酶（Benzonase) 是有活性的，但是其活性依賴于 Mg²⁺。核酸酶處理后加入 EDTA 以抑制金屬蛋白酶活性。

在培養基中處于對數生長期的大腸桿菌

Benzonase二硫蘇糖醇（DTT)抽提液Na2EDTA苯甲基硫酰氟（PMSF)

冷凍離心機圓錐形離心管超聲波儀

1.將培養基裝人質量已知的瓶子或管子中，12000 g、4°C 離心 5 min，以沉淀大腸桿菌。

2.棄去上層清液，完全吸干離心管。稱量瓶子或管子的毛重，去除皮重以確定大腸桿菌的重量。

3.在冷抽提液中重懸沉淀，每 1g 細胞用 1Oml 抽提液。將細胞懸液轉移到塑料圓錐形離心管中。每 1Oml 抽提液加 1 ul (500U)Benzonase 和 100ul 100 mmol/L PMSF。每加人一次液體之后都要上下顛倒混勻。將試管放在盛有冰的燒杯內。

4.在細胞懸液中，用超聲波處理細胞。將超聲波儀的輸出功率設定為最大值。每 15s 進行一次超聲處理，每次超聲處理之后冷卻細胞懸液，重復多次直到細胞懸液清澈。

5.每 1Oml 提取液中加0.5 ml 1.2mol/L DTT，顛倒混勻，將試管在冰上放置 15 min。

6.每 1Oml 提取液中加 100 ul 200 mmol/L Na₂EDTA, 顛倒混勾。

7.將裂解液轉移到離心管中，20000 g、4°C 離心 15 min。

8.測定上清液中的蛋白質濃度。

9.將上清液分成若干份，每 lOOul 為 1 等份。如果不立即用于 IEF，將其儲存在-80°C，避免多次反復凍融造成的副作用。

10.依方案 5 的步驟來完成第一向 IEF。對于第一向 IEF，蛋白質濃度應為 5~10 mg/ml。樣品可用水化液稀釋到準確濃度。