固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗6

蛋白質通過 IEF 進行分離之后，可進行第二向電泳，即 SDS-PAGE。本方案詳細介紹了灌制均一 SDS-PAGE 凝膠的方法。均一凝膠（具完全相同的%T和％c) 對特殊分子量范圍的蛋白質有較好的分離效果，因其灌制方法簡單而被普遍使用。

第二向凝膠可按三種不同方式（如尺寸）方便地制備：小膠用于 7 cmIEF 第一向凝膠；標準膠用于 11 cm、13 cm 以及 18 cm IEF 第一向凝膠；大型膠用于 18~24 cm 的 IEF 第一向凝膠。這些凝膠所用的試劑見下述，但在設備上要求不同。

如果凝膠用銀氨方法染色，凝膠中的硫代硫酸鈉可減少染色的背景水平（方案 11)(HochstrasserandMerril，1998, 見表 4.5 的注釋）。

過硫酸銨（10%)正丁醇乙醇4X凝膠緩沖液凝膠儲存液單體膠儲液SDS (10%)5XSDS 電泳緩沖液TEMED

凝膠灌制設備玻璃平板磁力攪拌子磁力攬拌器吸管隔片真空瓶水抽真空泵或其他真空裝置

1.安裝玻璃板之前，用乙醇浸過的無棉紙巾擦拭玻璃板，以確保無灰塵顆粒粘在玻璃板表面。

實驗提示：處理玻璃板的過程中要戴手套，以減少角蛋白和其他蛋白的污染。

2.對齊兩塊玻璃板，在兩邊放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔片。

3.用恰好足夠的壓力將兩塊玻璃板及隔片夾住，使其保持在適當的位置。將其底部立于水平面上，保證兩塊玻璃板底邊及隔片相互齊平，鎖緊夾子。

玻璃板的底邊和隔片相互齊平是很重要的，這能降低灌制膠時泄漏的可能性。

4.將裝配好的夾子裝人灌膠架，轉動旋鈕以使膠框（即夾在一起的玻璃板和隔片）卡緊于支架的塑膠條上。

5.用打字機或鉛筆標記一小條濾紙作為凝膠的標簽。將濾紙放在凝膠框的左邊底部，不要用標記筆，因其會溶出滲入凝膠。

6.用不脫色記號筆在玻璃平板外面離上沿約0.5 cm 處作標記。

7.在灌膠之前將水加人凝膠框來確定凝膠溶液的體積。在灌膠前從凝膠框中除去全部的水，否則凝膠中丙烯酰胺的濃度會受影響。在真空瓶中配制準確體積的凝膠溶液（由表 4.5 計算），TEMED 和過硫酸銨的體積忽略不計。

8.在溶液中加一個小磁力攪拌子，用水抽真空泵抽幾分鐘以除去溶液中的空氣，在磁力攪拌器上攪拌溶液。

雖然并非所有研究者都進行抽空氣這步，但為了更佳的重復性，建議進行此步操作。

9.在瓶中加 TEMED 和過硫酸銨，輕輕攪拌至混合，不要產生氣泡。

10.用吸頭緩慢加入凝膠 (從一個角落滴加），加至距上沿 0.5 cm。

11.立即在凝膠上方加一薄層（100~500ul) 水飽和的正丁醇以避免凝膠暴露在氧氣中，并且可使凝膠表面平整。

實驗提示：第二向膠的表面應該很平，這樣可更好地與第一向凝膠接觸。許多研究者用雙蒸水作覆蓋液，但這樣做可能會在凝膠上部稀釋丙烯酰胺濃度。

12.讓膠聚合至少 lh。

13.在聚合之后，檢查每塊膠是否完全聚合并且均一，同時檢測膠的上表面是否水平。用雙蒸水或去離子水清洗膠表面。

14.此膠可用于第二向電泳（方案 9)，并可在 4°C 儲存兩周。

儲存的膠應用膠儲液覆蓋，并且用塑料膜緊密纏繞好。