固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗8

已聚焦 IPG 膠條

瓊脂糖密封溶液蛋白質分子量標準5XSDS 電泳緩沖液

濾紙鉗子和多用尺子溫度控制儀電源SDS-PAGE 凝膠垂直電泳設備

1.在 100°C 加熱瓊脂糖封閉溶液使之熔化。每塊凝膠約需 1ml 溶液。完全熔化瓊脂糖要花 1Omin，最好在即將平衡 IPG 膠條時進行（方案 8)。瓊脂糖熔化后，將其冷卻至 40~50°C。

2.在第二向凝膠表面的平板之間用鉗子定位平衡后的 IPG 凝膠條，保證塑料支持條靠著其中一塊玻璃平板。在平板之間用一把薄的軟塑料尺子推動 IPG 膠條，直到 IPG 底邊和凝膠表面緊密接觸。從 IPG 膠條一端至另一端逐漸沿玻璃平板推動膠條。為了避免 IPG 膠條被撕破，應在凝膠的塑料支持面施力使 IPG 膠條放入適當位置。

保證在平板凝膠和 IPG 膠條底邊之間，以及塑料支持和玻璃平板之間沒有氣泡。如果有氣泡，輕壓 IPG 膠條的塑料支持趕走氣泡。如果氣泡在第二. 向凝膠上方，不要過重地壓 IPG 膠條表面，那樣可能會使 SDS-PAGE 凝膠上表面的孔徑縮小。

3.如果需要分子量標準，將準確劑量的分子量標準（對考馬斯染色來說需 200~1OOOng; 對銀染來說，需 10~50ng) 和已熔化的瓊脂糖封閉溶液混合，吸取 15~20ul 此混合物至一小張濾紙上。

4.瓊脂糖凝固后，將濾紙夾在兩個玻璃平板之間，以便它在 IPG 膠條末端和平板凝膠上部相連接。

如果凝膠將用于印跡，用抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶或抗生物素蛋白-堿性磷酸酶作蛋白質檢測，可使用生物素酰化標準。所使用的生物素酰化標準量見操作指導手冊。

5.緩慢吸取溶化的瓊脂糖封閉溶液至 IPG 膠條上，避免產生氣泡。在繼續下述步驟之前，瓊脂糖應冷卻并凝固至少 lmin。

在瓊脂糖內包埋凝膠條是為了固定膠條使之處于正確位置，確保 IPG 膠條和凝膠之間的良好連接。

6.按操作指導手冊，完成電泳裝置的安裝。連接冷卻裝置（如果有的話），使其保持凝膠溫度在 10~15°C。

雖然冷卻不是必需的，但這樣可大大減少凝膠之間的變化，并允許凝膠在高電流下電泳，這樣可減少電泳的時間。

建議標準和大型凝膠應冷卻，冷卻可大大提高凝膠之間的重復性，有助于減少人為的影響，例如凝膠的「微笑，，條帶。如果在實驗室中溫度有大的波動，冷卻就非常重要了。

7.按方案中表 7 或表 4.8 中建議的電泳條件來設置電泳儀，打開電源，開始電泳。

電泳分兩步進行。第一步持續時間較短，使用低電流或低功率設置，使蛋白產生最初的遷移和堆積，在電泳開始 5~15 min 之后（見表 4.7 和表 4.8)，檢查溴酚藍是否已進人凝膠；第二步，電流或功率要升高以允許快速分離。

8.當溴酚藍達到距凝膠底部 0.5~1cm 時，關掉電源，從電泳槽中將凝膠移出。

9.將凝膠水平放置，除去隔板，小心不要損壞凝膠，用塑料彈性刀片小心將每塊凝膠的兩塊玻璃平板分開。不要用金屬切片，因其會在玻璃板上留下劃痕。凝膠應該貼于其中一面玻璃板。

10.立即進行凝膠的染色（方案 10~方案 14) 或蛋白質的轉膜（方案 15~16 。

實驗提示：切忌讓凝膠干燥！如果必要，凝膠留在電泳槽中，繼續完成下一步方案的準備工作。