實驗概要
本實驗介紹了硝酸纖維素膜(NC膜)上的斑點免疫金銀染色操作流程。
實驗原理
蛋白質抗原通過直接點樣或轉移電泳吸附在硝酸纖維素膜(NC膜)上，與特異性抗體反應后，在滴加(或浸入)膠體金標記的第二抗體，結果在抗原抗體發生金顆粒聚集，形成肉眼可見的粉紅色斑點，稱為斑點免疫金染色(dot-IGS)。此反應可再提高銀顯色液增強，即斑點免疫金銀染色法(dot-IGS/IGSS)。
主要試劑
1. 20mol/L，pH7.6 PBS
2. BSA
3. 定影液：20%硫代硫酸鈉。
4. 0.05% NaN3
5. 一抗(1-2mg/ml，用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀釋)
6. 金標二抗溶液(金標抗體用含0.4%明膠和0.1%BSA的TBS適當稀釋)
7. 0.2mol/L，pH3.5枸櫞酸緩沖液
8. 銀顯色液
9. 定影液
主要設備
1. NC膜
2. 電泳儀和電轉儀
3. 微量加樣器
實驗步驟
1. 用微量加樣器在NC膜上直接點樣1-2ml(若抗原含量少，可重復點樣)，或經轉移電泳將抗原吸附在NC膜上，自然干燥；
2. 將點樣后的NC膜浸入含5%BSA和0.05% NaN3的20mol/L，pH7.6 PBS內，37℃，30min，以封閉未飽和的蛋白質結合位點；
3. 用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min；滴加適當稀釋的一抗(1-2mg/ml，用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀釋)，陰性對照用稀釋液代替抗體，在室溫下，反應2h；
4. 用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min后，將NC膜浸入金標二抗溶液中(金標抗體用含0.4%明膠和0.1%BSA的TBS適當稀釋)。反應時間視金標抗體的稀釋度而定：一般1：25稀釋(OD520 nm值約為0.2)，反應時間為2h；1：100-1：200稀釋(OD520 nm值約為0.005)，反應時間為16h；
5. TBS沖洗，即可觀察結果。此過程為dot-IGS。
6. 需要是可繼續進行銀顯色反應，行dot-IGSS：將金標抗體染色后的NC膜，用TBS洗三次，每次5min，再用蒸餾水洗滌兩次以去除Cl離子，浸入0.2mol/L，pH3.5枸櫞酸緩沖液內2min；
7. 移入銀顯色液中，避光顯色5-10min后，再移入定影液中，定影5min；
8. 自來水沖洗，自然干燥。