圖譜揭示細胞周期與胰腺命運之間的聯系

　　在多細胞生物胚胎發育過程中，一個前體細胞最終可以產生一種或多種類型的成熟功能細胞。明確原始胚層中每一個前體細胞產生的所有子代細胞類型及其發育路徑和軌跡，以單細胞分辨率洞悉細胞從原始胚層到各個組織器官發育成熟的“來龍去脈”，一直是發育生物學的基本問題和長期以來的研究目標，也是進一步深入理解細胞命運決定和分化機制的基礎，對于功能細胞體外分化和器官再生研究具有重要指導意義。近年來，雖然以“人工DNA條形碼”為代表的譜系示蹤技術取得了長足發展，但仍然難以在活體胚胎中實現任一單細胞標記及長時程可視化譜系示蹤，以追蹤被標記細胞所產生的所有子代細胞的最終命運。因此，目前以單細胞分辨率完成脊椎動物早期胚胎單個胚層乃至整個胚胎的全細胞（即所有細胞）命運圖譜存在技術障礙，阻礙了從單細胞水平深入理解細胞命運決定和分化機制。

　　2021年6月14日，西南大學羅凌飛課題組在PNAS在線發表了題為A single-cell-resolution fate map of endoderm reveals demarcation of pancreatic progenitors by cell cycle的研究論文，通過在斑馬魚胚胎中建立無偏見、可視化的前腸內胚層單細胞標記和示蹤技術，以單細胞分辨率繪制了原始前腸內胚層全細胞命運圖譜及增殖圖譜，并通過圖譜揭示了細胞周期與胰腺命運之間的聯系。

　　得益于斑馬魚胚胎原腸期結束后原始內胚層的單層細胞結構，研究人員通過從綠色到紅色單細胞熒光轉變技術，成功將原始內胚層中的任意單個前體細胞予以標記，隨后示蹤至胰腺、肝臟、腸道、肝胰管等消化器官原基完全形成的48 hpf（hours post fertilization）時期，利用被標記細胞的子代細胞會繼承紅色熒光，可確定被標記前體細胞產生的所有子代細胞的位置和數量（圖1）。

　　圖1：(A-C) 通過熒光變色對斑馬魚原始前腸內胚層進行單細胞標記和譜系示蹤。(D、E) 具體實例。

　　研究人員以原腸期結束后所有216個前腸內胚層前體細胞以及前端和后端部分細胞共273個內胚層前體細胞為標記和示蹤對象，對每個前體細胞開展至少5次獨立的單細胞標記和示蹤實驗，進而構建了原始前腸內胚層單細胞分辨率全細胞命運圖譜（圖2），明確了每個前體細胞所產生的子代細胞在前腸消化器官中的分布，并對胰腺、肝臟、腸道、肝胰管的前體細胞在原始前腸內胚層中的分布區域進行了精確劃分。

　　對前腸內胚層所有前體細胞開展活體單細胞標記和示蹤除了可以明確每個前體細胞的子代細胞位置外，還可以清晰地識別每個細胞在特定時間段（從原始胚層到48 hpf）所產生的子代細胞數目，由此可建立前腸內胚層單細胞分辨率全細胞增殖圖譜。根據圖譜，研究人員發現，位于中軸線兩側的胰腺前體細胞增殖速度明顯慢于其它消化器官前體細胞。利用細胞周期指示系統（Fucci Sensor）開展活體單細胞實時成像顯示：胰腺前體細胞的平均G1期持續時間明顯長于周圍其它類型前體細胞（14小時 vs 6小時），這種長G1期細胞周期特征是細胞自主性決定胰腺命運傾向的關鍵因素之一（在胰腺前體細胞中縮短G1期會使得細胞丟失胰腺命運，在周圍其它類型前體細胞中延長G1期會使得細胞獲得胰腺命運）。

　　這是第一張單個胚層核心區域的單細胞分辨率全細胞命運圖譜，使得每一個前腸內胚層前體細胞的命運變得清晰。在各消化器官前體細胞缺乏分子標記的原腸期結束時的原始胚層中，精確界定各器官前體細胞區域是隨后深入理解各類細胞命運決定的早期事件、是從單細胞水平解析細胞間相互作用調控細胞命運的基礎，也使得研究人員可以在未來對任何一個前體細胞的行為和遺傳特征進行深入探究。本研究也運用圖譜揭示了細胞周期與胰腺命運之間的聯系，從細胞周期的角度為胰腺發育提供了新見解，也為通過圖譜理解消化器官前體細胞命運決定的早期事件提供了具體示例。

　　由于熒光蛋白降解、隨細胞分裂的熒光蛋白稀釋、熒光淬滅等原因，本研究中熒光轉變產生的紅色熒光僅能有效示蹤48小時左右（從原始內胚層形成至60 hpf），無法長時程示蹤至消化器官發育成熟時期。活體單細胞標記及長時程可視化譜系示蹤技術還有待開發建立。