圓二色性（Circular dichroic，CD）測定
1%(w/w)的蛋清溶液調節到pH 4.0，6.0，10.0，在85oC加熱不同時間，離心，取上清液，然后稀釋至100~200μg/mL溶液。對照組為天然蛋清樣品。用Jasco J-715光度計測定樣品的CD譜。測定條件設定：測定波長范圍190~250 nm，25oC，比色皿光徑1 mm，分辨率0.2 nm，掃描速率100 nm/min，掃描5次。使用Jasco SSE軟件確定樣品的二級結構百分含量。
3.4.6蛋白質的二級結構對DH的影響
蛋白酶的水解反應還受到蛋白質的結構的影響，一般結構緊密的蛋白質提供的酶切位點少于結構松散的蛋白質。因此有必要研究蛋白質結構對DH的影響。蛋白質的熱處理可能引起二級、三級和四級結構的變化。從二級結構看，α-螺旋結構表現蛋白質分子的有序性，而其結構如β-折疊、β-轉角、無規卷曲等反映了蛋白質分子的松散性[26]。蛋白質分子的有序性差，越有利于蛋白酶的水解。目前，研究蛋白質構象最好的方法是x-射線衍射，但對結構復雜、柔性的生物大分子蛋白質來說，制備蛋白質單晶較為困難。二維、多維核磁共振技術能測出溶液狀態下蛋白質分子的構象，可是對分子量較大的蛋白質的計算處理非常復雜。相比之下圓二色性是研究稀溶液中蛋白質分子構象的一種快速、簡單、較準確的方法。圓二色性在紫外區段(190~240 nm)，主要生色團是肽鏈，這一波長范圍的CD譜包含著生物大分子主鏈構象的信息。在一般情況下，實驗中得到的CD譜線是α-螺旋、β-折疊和無規卷曲構象的CD譜的線性迭加[27]。圖3-7顯示天然蛋清的CD譜線a在222 nm處和208 nm處呈負峰，在190 nm附近有一正峰，這是存在部分α-螺旋構象的特征。譜線b、c、d、e在221 nm處的負譜帶減弱，意味著α-螺旋的百分比減小。譜線b、c、d、e向短波長方向移動，即發生藍移。由于發色團吸收光譜發生位移主要取決于它的微環境更加親水或疏水的結果[28]，因此譜線b、c、d、e藍移的發生說明體系的親水性降低,即疏水性增加。表3.3列出了天然蛋清和熱處理蛋清的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲構象所占的比例。從表中可以看出，通過熱處理，天然蛋清的α-螺旋比例下降，而β-折疊和無規卷曲的比例增加，說明蛋清蛋白分子結構的有序性降低，形成了以β-折疊和無規卷曲為主的二級結構。
圖3-7天然和熱處理的蛋清的CD光譜
a-天然蛋清；b-pH4，85oC加熱36 min蛋清；c-pH6，85oC加熱36 min蛋清；d-pH10，85oC加熱30 min蛋清；e-pH10，85oC加熱60 min蛋清。