一、目的和內容
目的：學習從土壤中別離微生物的辦法,學習無菌操作技術.
內容：
1．用稀釋法別離細菌、放線菌和霉菌.
2．用平板劃線辦法別離微生物.
3．學習斜面接種及穿刺接種等無菌操作技術.
二、資料和用具
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜面菌種.
牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培育基各1瓶,49.5mL無菌水(帶玻璃珠)1瓶,4.5mL無菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.
無菌培育皿12套,1mL無菌移液管10支,土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮.
三、操作步驟
(一)土壤稀釋別離：
1、取土壤：取表層以下5—10cm處的土樣,放入無菌的袋中備用,或放在4℃冰箱中暫存.
2、制備稀釋液(要無菌操作)
(1)制備土壤懸液：
稱土樣0.5g,疾速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠用量以充溢瓶底力最好),振蕩5～10min,使土樣充沛打散,即成為10-2的土壤懸液.
(2)稀釋：
用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL,放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液,如此反復,可依次制成10-3～10-8的稀釋液(圖 3-1).留意：操作時管尖不能接觸液面,每一個稀釋度換用一支移液管,每次吸入土液后,要將移液管插入液面,吹吸3次,每次吸上的液面要高于前一次,以 減少稀釋中的誤差.
3、混菌法測定菌落數的辦法
(1)細菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL,分別接人相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個平皿.然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培育基,分別倒入以上培育皿中(裝量以鋪滿皿底高1.5～2mm為宜),疾速悄悄搖動平皿,使菌液與培 養基充沛混勻,但不沾濕皿的邊緣,待瓊脂凝固即成細菌平板.倒平板時要留意無菌操作.
(2)放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液,在每管中參加10%酚液5～6滴,搖勻,靜置片刻,然后分別從兩管中吸出1mL參加相應標號的平皿中,選用高氏1號培育基,用與細菌相同的辦法倒入平皿中,便可制成放線菌平板.
(3)霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL,分別接入相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個平皿.在消融的土豆蔗糖培育基中,每100mL參加滅菌的乳酸1mL,悄悄搖勻,然后用與細菌相同的辦法倒入平皿中,便可制成霉菌的平板.
4、培育：將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置,即皿蓋朝下放置,于28～30℃中恒溫培育,細菌培育1～2d,放線菌培育5～7d,霉菌培育3～5d.察看生長的菌落,用于進一步純化別離或直接轉接斜面.
(二)平板制造及劃線別離辦法：
1．倒平板：按無菌操作請求,在火焰旁操作,做法如3(1).
2．劃線別離：運用接種環,從待純化的菌落或待別離的斜面菌種只沾取少量菌樣,在相應培育基平板中劃線別離,劃線的辦法多樣,目的是取得單個菌落,.
(三)斜面接種和穿刺接種：
1．斜面接種
(1)取新穎固體斜面培育基,分別做好標志(寫上菌名、接種日期、接種人等),然后用無菌操作辦法,把待接菌種接入以上新穎培育基斜面上.
(2)接種的辦法是,用接種環沾取少量待接菌種,然后在新穎斜面上“之”字形劃線,方向是從下部開端,不斷劃至上部(圖3—4A).留意劃線要輕,不可把培育基劃破.
(3)接種后30℃ 恒溫培育,細菌培育48h,放線菌、霉菌培育至孢子成熟方可取出保管.
2．穿刺接種
(1)取兩支新穎半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培育基,做好標志(寫上菌名)、接種日期,接種人等).
(2)接種的辦法是,用接種針沾取少量待接菌種,然后從柱狀培育基的中心穿入其底部(但不要穿透),然后沿原刺入道路抽出接種針,留意接種針不要挪動.
(3)接種后30℃恒溫培育, 24h后察看,比擬兩種菌的生長結果.
四、留意事項
1．普通土壤中,細菌最多,放線菌及霉菌次之,而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中,故從土壤中別離細菌時,要取較高的稀釋度,否則菌落連成一片不能計數.
2．在土壤稀釋別離操作中,每稀釋10倍,最好改換一次移液管,使計數精確.
3．放線菌的培育時間較長,故制平板的培育基用量可恰當增加.
五、實驗結果
記載土壤稀釋別離結果,并計算出每克土壤中的細菌、放線菌和霉菌的數量.
計算辦法：選擇長出菌落數30～300之間的培育皿停止計數,按以下公式：
總菌數/g=同一稀釋度幾次反復的菌落均勻數×稀釋倍數
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