| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
ATP (10 mmol/L)，乙醇，10x 接頭激酶緩沖液，苯酚：氯仿（1:1, V/V），乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)，TE ( pH 8.0)。
2. 酶及緩沖液
T4 噬菌體 DNA 連接酶，多聚核苷酸激酶，限制性內切核酸酶。
3. 核酸和寡核苷酸
外源或目的 DNA 片段，人工合成的寡核苷酸或接頭，用 TE ( pH 8.0) 溶解，終濃度約為 400 ug/ml。
4. 專用設備
層析設備，溫度可調至 65℃ 的水浴裝置。
二、方法
1. 在一無菌離心管內進行接頭的磷酸化：
合成的寡核苷酸或接頭 0.5~2.0 ug TE（pH 8.0）溶解，10x 接頭激酶緩沖液 1.0 ul，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H2O 加至 10 ul，T4 噬菌體 DNA 連接酶 1.0 單位，反應體系置于 37℃ 溫育 1 h。
沒有必要鈍化出磷酸化的接頭，因為可在反應混合物中直接進行連接反應。
2. 磷酸化接頭與補平的 DNA 片段連接的反應體系如下：
DNA 片段 100~200 ng，磷酸化接頭 摩爾數超過 10~20 倍，10x 連接酶緩沖液 1.0 ul，T4 噬菌體 DNA 連接酶 0.1 Weiss 單位，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H2O 加至 10 ul，連接混合物于 4℃ 放置 6~16 h。
為獲得最大效率的連接，反應體系越小越好，一般為 5~10 μl。在反應混合物中，ATP 作為 10X 連接緩沖液的組分，可為載體和外源 DNA 片段的體積提供更大的空間。有些廠家的連接緩沖液中已含有 ATP, 這樣在應用時就不必另加 ATP 了。
3. 65℃ 溫育連接反應混合物 15 min, 以滅活 DNA 連接酶。
4. 用 10 ul 適當的 10x 限制酶緩沖液稀釋連接產物。補加蒸餾水使終體積 100 ul 中含有 50~100 單位的限制酶。
5. 反應體系于 37℃ 溫育 1~3 h。
限制酶可從 DNA 片段的末端上除去多聚合體，并形成凸出末端。在反應體系中有大量接頭存在，需要用大量限制酶來消化。
6. 用苯酚：氯仿抽提反應混合物一次，然后用乙醇沉淀回收 DNA。
7. 于 4℃ 用微量離心機以最大速度離心 15 min 以收集 DNA 沉淀，用 50 ul TE ( pH 8.0) 重新溶解 DNA 沉淀。
8. 將獲得的 DNA 溶液過層析柱，以去除過量的接頭及酶切小片段。
9. 經修飾的 DNA 片段現在可被用于與帶凸出末端的質粒 DNA 連接。 |
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