3、在線稀釋技術的應用 3 —— 雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS
大體積進樣量有可能會帶來一個問題，即基質雜質增加，影響定量準確度。固相萃取SPE是一種有效的樣品富集和除雜手段，廣泛應用于食品、環境或生物樣品的前處理。但手工操作的離線SPE存在操作繁瑣復雜、耗時、重現性差等缺點，而在線SPE-HPLC可以部分解決以上問題。
目前的在線SPE-HPLC系統一般分為兩步進行，第一步是富集+除雜質，第二步是解吸+分離。見圖5所示。該系統通常由兩個流路連接一個六通閥組成，萃取柱連接在六通閥上。第一個流路(虛線部分)是提取和富集，另一個流路(實線部分)是樣品的解吸和高效液相色譜分離。分析開始時，樣品由自動進樣器導入，隨后被液相泵推動通過SPE柱完成目標物的富集(弱保留雜質流經SPE柱而無保留)。然后切換閥門，SPE柱被切換到兩個色譜泵和色譜柱之間，流動相A和B兼任解吸液，將目標物從SPE柱上解析下來并隨后進入色譜柱進行分離分析。
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圖5.在線SPE系統常見的配置和流路構造 |
然而，這個系統有幾個缺點：首先解吸分離步驟中，SPE柱連在兩個泵和色譜柱之間，這意味著只能耐受常壓的SPE柱要承受和高效液相色譜柱相同的壓力；其次，如果使用與這個SPE柱相匹配的常規色譜柱，通常直徑為4.6mm，最優流量為1mL/min，超出了ESI源離子化承載的流量，因此需要通過降低流速或柱后分流等手段減少ESI負荷，最終導致方法靈敏度下降；第三，流動相A和B兼任解吸液和分離溶液，在大多數情況下，最佳解吸溶液與最佳流動相不是同種溶液，最終導致解吸效率下降或峰展寬；最后，樣品為生物樣品或高比例強溶劑萃取液時，在進樣前需要用弱溶劑離線稀釋，雖然離線稀釋即耗時又間接減小了進樣濃度，但非常有必要：一是將目標化合物與基質脫附(如藥物與蛋白質的脫附)；二，將高比例強溶劑稀釋為高比例弱溶劑，以提高過柱過程中在萃取柱上的保留。
為解決以上缺點，島津設計了雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統，其配置和流路設計見圖6。
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| 圖6. 雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統的硬件配置和流路設計；ZL號CN103940941B |
這個系統有三個分析步驟：
(1)第一步是樣品的稀釋和提取。樣品通過自動進樣器直接注入系統，通過泵D稀釋溶劑推送進入高效混合器1，樣品被在線稀釋為弱溶劑。然后稀釋液加載到固相萃取柱完成目標物的富集及雜質的去除。
(2)當富集除雜完成后，切換閥1，進行目標物的解吸和捕獲。在這一步中，泵C推送最優的解吸液到固相萃取柱，目標物被解吸液解吸并移動經過500μL定量環，調整分析方法至絕大部分目標物捕集到定量環1中，切換定量閥進入第三步。
(3)第三步是解吸液的柱前稀釋，以及進行超高壓的樣品分離分析。柱前稀釋的原理即為此前提到在線稀釋，可即時將解吸液稀釋為90%以上的弱溶劑，然后才進入超高壓液相色譜柱。此時弱溶劑完全沒有洗脫能力，因此目標物將在色譜柱頭進行聚焦。之后改變有機相比例，實現梯度洗脫，得到尖銳的色譜峰形。在此過程中實現了解吸液的柱前稀釋、超高壓的色譜分離。此時超高壓色譜柱使用的是最優流速，且無需分流，與質譜完美匹配，提高分析的靈敏度。
該在線系統相對于普通SPE-HPLC系統有以下優點：
(1)實現萃取前樣品的在線稀釋，免除離線稀釋的手工誤差；
(2)破除分離色譜柱的局限性，可以使用UHPLC高壓柱，分離條件與SPE萃取條件相互獨立，與ESI質譜相匹配；
(3)獨立解吸泵推送解吸液：可以使用最優解吸條件，并具有解吸效率最高，解吸時間最短，解析液體積最小等優點；
(4)解吸溶劑的截獲&切換：在解吸條件最優的條件下，使用500 μL定量環(可隨SPE尺寸調整)，確保解析液全部被截獲；定量環還起到壓力過度作用，SPE柱不與UHPCL柱串聯，全程處于低壓狀態；
(5)大體積解吸溶液的在線稀釋，實現柱頭聚焦和有效UHPLC分離。
我們用這個系統先后應用于植物提取液中三種植物激素和血漿樣品中十種抗精神病藥的直接檢測，得到了滿意的結果：
(1)雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統用于植物提取液中植物激素的直接檢測
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| 圖7. 雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統用于植物提取液中三種植物激素的直接檢測； Qisheng Zhong, et al. Journal of Chromatography A, 2014. 1359: 131-139. |
(2)雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統用于血漿中十種抗精神病藥的直接檢測
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圖8.雙步稀釋SPE-UHPLC-MS/MS在線分析系統用于血清中十種抗精神病藥的直接檢測； |
由以上應用實例我們可以看到，使用島津獨有的在線稀釋技術，可以大大提高超液相色譜的飯量，不但能提高靈敏度，而且能夠應用在在線分析系統，實現目標物的富集和雜質去除，得到滿意的分析結果。