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一、材料
1. 緩沖液和溶液
ATP (10 mmol/L)，乙醇，聚乙二醇（30%，m/V，PEG 8000 溶解），乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2 )，TE ( pH 8.0)。
2. 酶與緩沖液
T4 噬菌體 DNA 連接酶，限制性內切核酸酶。
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠。
4. 核酸和寡核苷酸
外源或目的 DNA ( 帶平末端），載體（質粒）DNA。
二、方法
1. 分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化 1~10 μg 質粒 DNA 和外源 DNA 片段，使它們能產生平末端。
2. 苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源 DNA 片段。
根據實驗情況，參照中性瓊脂搪凝膠或聚丙嫌酰胺凝膠電泳方法從分離出外源
DNA 的目的片段，是必要的或可以獲得理想結果的。當外源 DNA
制備物中含有能與載體連接的多個限制酶酶切片段時，一般需要做這種分離。許多研究者在連接反應前，寧愿采用瓊脂糖凝膠電泳方法來提高外源目的 DNA
序列的鈍度，而不是從大量的轉化子中篩選陽性克隆。
3. 分別用 TE ( pH 8.0) 重新溶解純化出的兩種 DNA 沉淀，使終濃度約為 100 ng/ml。假設 1 bp 相當于 660Da，計算 DNA 的終濃度（pmol/ml)。
分別取少量樣品，用瓊脂糖凝膠電泳確定兩種 DNA 的近似濃度（取整數）。
4. 將載體 DNA 去磷酸化。
5. 按下表將適量的 DNA 轉移至無菌的 0.5 ml 離心管：
(1) A、B 和 C 管中加入：10x 連接緩沖液 1.0 μl，T4 噬菌體連接酶 0.5 Weiss 單位，5 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 補至 8.5 μl，30% PEG 8000 1~1.5 μl。
(2) D、E 和 F 管中加入：10x 連接緩沖液 1.0 μl，5 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 補至 8.5 μl，30% PEG 8000 1~1.5 μl，不加 DNA 酶。
為獲得最大的連接效率，反應體系越小越好，一般為 5~10 μl。在反應混合物中，ATP 作為 10X 連接緩沖液的組分，給載體和外源 DNA 片段提供了更為廣闊的空間。有些廠家的連接緩沖液中含有 ATP，這樣在應用時就不必另加 ATP 了。
在制備
DNA 片段過程中，可以將 DNA 片段與水一起加入管中于 45℃ 溫育 5
min，以消除制備過程中片段間可能形成的聚合。在連接反應試劑加入之前，可將 DNA 溶液于 0℃ 預冷。關鍵的地方是：① 在加入 PEG
(30%) 之前使反應體系預熱至室溫；② 最后加入 PEG。否則，在 PEG 8000 存在的低溫溶液中 DNA 會形成沉淀。
6. 連接反應體系置于 16℃ 水浴溫育過夜或 20℃ 水浴溫育 4 h。
7. 用每份稀釋的連接產物轉化感受態大腸桿菌。轉化時，應包括用標準方法制備的已知量的超螺旋質粒 DNA 作為對照，以檢査轉化效率。
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