在MD兩款酶標儀上應用PromegaCellTiterGlo化學發光法檢測...

在MD兩款酶標儀上應用Promega CellTiter-Glo化學發光法檢測細胞活性

介紹

Molecular Devices公司的SpectraMax? L及SpectraMax?M5型號酶標儀結合Promega公司的CellTiter-Glo化學發光細胞活性檢測試劑盒能進行快速靈敏的活細胞數量測定。CellTiter-Glo檢測法使用了螢光素酶，需要ATP使其反應發光。發光信號強度由ATP量決定，而ATP的多少取決于活細胞數目。SpectraMax? L及M5酶標儀均能提供96孔和384孔化學發光檢測功能。

材料

CellTiter-Glo化學發光細胞活性檢測試劑盒(Promega公司，貨號G7570)，包括CellTiter-Glo緩沖液和CellTiter-Glo底物(凍干粉)

CHO-K1細胞(ATCC，貨號CCL-61)

白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，貨號655075和781075)

SpectraMax? L化學發光微孔板檢測儀或SpectraMax? M5多功能微孔板讀板機

方法

準備CellTiter-Glo試劑使用前將CellTiter-Glo緩沖液和底物在室溫中平置解凍。然后將緩沖液倒入裝有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手冊中指示，溫和顛倒瓶子以混勻。

細胞計數及產生發光信號

用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham’sF12培養基培養CHO-K1細胞。胰酶消化后使細胞懸浮在培養基中，并進行細胞計數。用96孔板檢測時，每孔中加入100ul細胞懸液，細胞濃度從50000個/孔稀釋到24個/孔。384孔進行檢測時，每孔中加入25ul懸液，細胞濃度從12500個/孔稀釋到25個/孔。空白孔中加入不含細胞的培養基，用于檢測背景光值。

為了確保CellTiter-Glo檢測中細胞數量的準確性，細胞不能貼壁和生長，但能及時被檢測到。每孔中加入100ul(96孔板)或25ul(384孔板)CellTiter-Glo試劑。然后將微孔板放在振蕩器上溫和振蕩混勻2分鐘，室溫孵育10分鐘，使其產生穩定的發光信號。

制作ATP標準曲線

ATP標準樣品用培養基制備，濃度范圍從100 fmol/孔到1nmol/孔(96孔板)，或25 fmol/孔到250 pmol/孔(384孔板)，按上述同樣體積加入微孔板中。空白對照孔加入不含ATP的培養基。適量CellTiter-Glo試劑加入每孔，并按上述步驟孵育。

儀器設置和樣品分析

檢測板用SpectraMax? L和SpectraMax?M5酶標儀進行讀數，并使用SoftMax? Pro軟件中預設參數的CellTiter-Glo模板。根據Promega推薦，檢測時間設置為1秒。然后在SoftMax? Pro軟件上進行平均發光強度和標準偏差計算，細胞濃度稀釋曲線和ATP標準曲線作圖。

結果

SpectraMax? L和SpectraMax? M5酶標儀均最低能檢測24個細胞/孔(96孔板)和6個細胞/孔(384孔板)。因此其靈敏度高于比色法和熒光檢測法。CellTiter-Glo化學發光檢測值在所用的細胞濃度范圍內呈線性分布，并達到大于3個數量級的動態范圍(r2= 0.99)。(見圖1)

ATP標準曲線能用于驗證試劑盒以及計算細胞ATP含量。ATP標準曲線中ATP濃度范圍對應檢測值覆蓋了細胞數量檢測中的發光值全部范圍(見圖2)。檢測值至少在4個數量級范圍內呈線性。

結論

SpectraMax? L和SpectraMax? M5酶標儀均為CellTiter-Glo檢測提供了優異的檢測靈敏度。SpectraMax? L化學發光讀板機帶有自動增益功能，能同時進行模擬信號和光子計數，提供大于9個數量級的動態范圍，對于高信號值樣品無需稀釋，同時對于低信號樣品具有優越的靈敏度。

SpectraMax? M5多功能讀板機為使用者提供了除化學發光以外的其他檢測方法，例如：光吸收，熒光強度，熒光偏振和時間分辨熒光。

SpectraMax? L和SpectraMax? M5酶標儀均用SoftMax? Pro軟件進行操控和設置，該軟件含有CellTiter-Glo檢測模板和其他120多個分析模板，這些模板已預設參數，方便數據整理和分析。兩種酶標儀均能整合MD公司的StakMax?微孔板移動機械臂，以實現微孔板的自動裝卸。