這一部分著重討論一些對成功記錄光學十分重要的方法學問題或實驗技術，但不介紹單一的方法，因為實驗中進行光學記錄的方法實際上是各種各樣的，也就是說，這里只考慮所有實驗中都常見的因素。在這些因素中很多是很普通的，但它們經常是實驗成功和不必要的失敗之間的差別之所在。這些因素包括： 一光指示劑的配制與儲存 —負載和染色方案 一實驗設計 一校準步驟 —信號處理方法 一、光指示劑的配制與儲存1.VSD 的溶解和儲存溶解和儲存這些指示劑沒有一個統一的方法，大多數情況下，各種染料配制的最佳條件都是經驗性的。因為雙嗜性分子的特性，大部分 VSD 并非天然水溶性』有時需要表面活性劑去溶解它們。同時，有時也需要用其他試劑幫助這些染料滲入細胞膜內，這樣的試劑包括各種溶劑或其混合劑，以及表面活性劑，如：乙醇（EtOH)、甲醇 (MeOH)、二甲亞砜（DMSO)、二甲基甲酰胺（DMF)、聚醚（Pluronic)F-127、膽鹽 (如膽酸鈉)、染色小泡。 常用于單細胞研究的 VSD 的溶解和儲存方法例示如下：
 2.CaSD 的溶解和儲存離子敏感性指示劑一般分為兩類：游離鹽類和乙酸甲基（AM) 酯類。這兩類 CaSD 在溶解與儲存上是各不相同的。游離鹽類：大部分 CaSD 游離鹽是水溶性的，而且無論是溶解狀態還是固體狀態都可在-20T：下長期穩定保存。通常這些鹽類用于微量注射或透析，故可用純水（無鈣）配制濃縮的儲存液。制備這些溶液沒有什么特殊要求，不過，將其制備成濃縮母液（50?IOOX) 分裝保存更好些。這些分裝的母液應在干燥、-20X：保存。 注意：有些研究者將這些染料和膜片鉗電極內液混合后冷凍儲存，不過我們的經驗提示，用這種方法儲存的染料會降解得更快些。
二、負載/染色方案光指示劑的負載/染色有多種可能的方法，這些方法分為兩類：成批負載和單細胞負載。 在成批負載研究中，所有存在的細胞都被負載，或者說是無差異染色。成批負載的方法包括： —浴槽孵育 一 AM 酯負載 一電穿孔 —陽離子脂質體轉導 —低滲振蕩 最常用的介導鈣染色劑進入細胞內的方法是利用 AM 酯。AM 酯屏蔽染料分子的強負電荷部分（表 4-2)，所以能滯留于細胞膜上。AM 酯一旦進入細胞，非特異性酯酶將鈣敏感性染料上的酯類清除掉，而染料就在細胞內了。在單細胞研究中通常通過微量注射法或膜片鉗電極透析法進行負載，也可用局部電穿孔的方法。 下面介紹的是光學記錄中最常用的三種方法：①孵育法；②微注射法；③透析法 (通過膜片鉗電極)。 在每一具體情況下，最佳的染色/負載條件依賴于所使用的指示劑而定。通常最佳條件的確定都是經驗性的，但如下列舉的幾個代表性例子可以作為指導。
三、實驗設計利用光學指示劑進行實驗的設計和實施，需要認真考慮諸多因素，其中有些因素是獲得有用的數據和避免偽跡性結果的先決條件。這些因素的考慮可分為兩類，即對所有實驗都適用的一般因素，以及專門對光學指示劑的實驗適用的因素。 1.一般設計應考慮的方面要對實驗操作或用藥產生作用進行可靠性判斷，需要滿足幾個基本的標準： 一測量的基線：實驗操作或應用藥物之前是否有穩定的基線？ 一重復性：所觀察到的實驗結果是否可以重復？ 一可逆性：在撤銷實驗操作或藥物后實驗作用能否恢復如初？ 一等級反應：反應是否隨刺激強度的改變而呈等級性變化？ —藥理學特征：反應能否被相應的藥物阻斷或增強？ 2.特殊設計應考慮的方面特殊用于光學指示劑的實驗設計，通常要考慮：染料的使用、信號的優化，以及附加電生理技術的結合。 染料的選用：需要建立特殊標準以判斷染料的濃度和 (或) 靈敏度在整個實驗中是否穩定。染料濃度和靈敏度的非均一問題，可以由膜片鉗電極的不完全透析或電壓敏感性染料的內化所致。通常用標準或對照刺激引起的反應來確認反應性的穩定。 信號的優化：有時，總體信號中含有特異和非特異信號，因此要想方設法區分這些成分。非特異性熒光的一個例子是由細胞產生自身熒光。這種內在發射的焚光不依賴于其他外在熒光分子，在用靠近紫外光波的光源照射生物樣品時，自身熒光就成了一個問題。解決這個問題的方法是：先測量沒有光學指示劑時細胞的熒光，再在有染料存在的靜息熒光值減去該值。這個值一般在染色之前測量，或在實驗中染料未染色的相同區域測量。另外一個重要的實驗問題在于是否需要平均信號或進行數字化過度采樣，以檢測到我們想觀測的信號。在信號較小并需要平均的情況下，必須采集足夠同樣的記錄以進行平均處理。最后，如果光源強度大，應當考慮是否需要漂白校正，漂白校正通常是進行對照記錄，對照記錄是在實驗條件下，沒有進行刺激或實驗操作過程中采集的。 綜合：光學記錄與電生理技術的結合，往往需要特定的程序改變。例如，溶于溶劑尤其是 DMSO/F-127 中 VSD，會阻抑膜片鉗電極與細胞膜的封接，所以有時在細胞染色前就形成這種封接是必要的。 四、校準的方法如果實驗的目的是需要一個定量的結果或測量所需參數絕對的變化值，那么就必須進行光學信號校準<；同樣，如果要求在不同的實驗中進行信號的比較，或在同一實驗中比較不同點的信號，這些信號都要進行校準。如果用定量法記錄所有的信號，就展示出它的優點了，不過因為其他原因這種方法并非一定能用上，如經常涉及的記錄帶寬等。 光學信號的校準常從以下方法中選用：單一波長測定法、比值測定法、混合測定法。 毋庸置疑，比值測定法可得到最可靠的結果。此法可在對激發光或發射光具有光譜偏移的一些指示劑使用，這依賴于所需觀察的變量。這些光譜偏移允許對熒光強度變化方向相反的兩種波長進行比較，或單一波長與光譜 isosbestic 點（即對所測參數不敏感點）的比較。除了能提供定量的結果外，比值測定法還可降低或排除由以下原因引起的熒光系統性誤差：指示劑濃度；激發光路長；激發光強度；探測器效能。 更為重要的是，比值測定法還能排除許多偽跡和非系統性因素，包括：光漂白；指示劑超時漏出；指示劑分布不均；不同的細胞厚度。 在有些情況下，比值測定法也更加敏感，因為每一波長的熒光變化通常都是反向變化的信號，故信號比值的變化比任一單波長的變化更大。 不過在一些實驗條件下，應用比值測定法是不合實際的，這就可以應用混合測定法 (Lev-Rametal.1992)。混合測定法就是在不同的瞬時，將定量測定與定性估測相結合，例如，初始基線可用比值測定法進行定量測定。隨后，可以用高得多的測量頻率, 對單波長相同參數的快速變化進行定性的測量。不過，要重點注意的是，這種方法假設在單波長測量法記錄過程中，所有其他的變量（尤其是指示劑濃度）都是保持不變的。 比值測定法與非比值測定法都已用于鈣敏感性染料和電壓敏感性染料。每一類型的校準方法將在下文舉例論述。表 4-6 用圖示法概括了各種情況下如何進行的測量。此外，將兩類指示劑都常用的一般指導原則也概述如下： 1.VSD 校準電壓敏感性熒光染料通常被稱為「無刻度線性電壓表」。不過它們只能提供電壓改變的信息，而電信號的絕對振幅則因染料染色的不同和局部敏感性的變異而不同。因此，這些染料最常用于點之間的非校準的絕對比較，樣本間的比較是不可行的。然而，校準的測量在某些情況下也是可能的，其測量是否成功，很容易通過同步電測量進行驗證。此類型的測量包括下述檢測：單波長法；基于一個激發光譜偏移的雙激發光波長法；基于一個發射光譜偏移的雙發射光波長法。
<img alt=”的校準方法（ Zhang etal. 1998)。這種激發比值構成法的弊端，在于需要交替兩個圖 像和/或轉換激發光謔光片，這不僅費時而且限制了總體時間帶寬，不能滿足獲取快速 事件如動作電位的要求9 標準化的比值數據轉換為絕對膜電位值（ mV) 的公式為 V m = C F X R ‘ 式中， CF指比值數據與膜電位值之間的轉換因子； J?’指標準化的比值（ 通常標準化到 ? R為 OmV)。 3 . 用在基于一個發射光譜偏移的雙發射光波長的、可檢測膜電位絕對變化的比值 測 定 法 （BullenandSaggau 1999; BeachetaL 1996):這是用指TTC 劑測量膜電位變化 的又一種比值測量法，即使用單激發光波長的同時測量雙發射光波長，此法依賴于電壓 敏感染料di-8-ANEPPS的發射光譜呈現的電壓依賴性光譜偏移。通常，使用后繼雙向 光束分光儀（ 如 DCLP5 7 0 ) 或三棱鏡和雙光電探測器（ 2.CaSD 的校準此類指示剤有三種可能的校準方法，它們分別是：單波長法；基于一種激發光偏移或一種發射光偏移的比值法；混合法。
3.用于光指示劑校準的一般指導原則將光學測量值轉換成所觀察生理參數的重要一步，就是實驗后校準。盡管在溶液或各種簡化的標本（如小泡）中，可測到用于電壓和鈣離子指示劑校準的轉換因子，但這些條件一般并不符合細胞內環境的真實值。在這些情況下不能很好重復的因素有：溫度、pH、離子濃度、染料與蛋白質或膜的交互作用。 而且，一些 CaSD 和細胞內蛋白質的相互作用也被發現能改變表觀 2^〇^^-bayashietal.1993)。簡言之，原位校準要優于等效的離體過程，因此要盡可能采用前法。 這些校準法通常可用破孔離子載體的細胞化學鉗方式完成_^例如，膜電位比值可用纈氨霉素校準，即特異地將一系列纈氨霉素介導的 K+擴散電位，用于建立欲測膜電位范圍的梯度，并同時測定熒光比值。此過程的細節請參閱 Loew(1994)。同樣的，鈣離子比值測定法也可用離子載體如伊屋諾霉素或卡西霉素（或其類似物 4-brom 〇-A23187) 進行原位校準? 但是，用這些化合物時應注意，它們具有相當強的自身熒光，特別在紫外光下更明顯。這些方法的細節描述請參閱 Kao 所寫的相關章節（Nucdtelli1994)。 本章也會討論一些校準過程中的一般設想與實際的局限性。 注意：一般在計算比值或 AF/F 前先要減去任何自身熒光值或其他偏差。
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