培養瓶中單層培養細胞生長曲線的繪制

材料

無菌
單層細胞培養，A549,Vem 或 HeLa-S3, 75 cm² 培養瓶，晚對數期 1 瓶

0.25% 粗制胰蛋白酶，混合有 lOmmol/L EDTA 5 ml

生長液，含 2 mmol/LNaHC0₃ 200 ml

D-PBSA(用于清洗和細胞計數）50 ml

25 cm² 培養瓶 24 個

操作步驟

1. 對于一般的傳代，先用胰蛋白酶消化細胞（見方案 13.2)。

2 . 稀釋細胞懸液分別至 2X10⁴ 個細胞/ml，150 ml 培養基。

3 . 接種于 24 個 25 cm² 培養瓶。

4． 封好培養瓶，然后置于 37°C 溫箱內。

提示 用低碳酸鹽（4 mmol/L) 培養基對本方案有方便之處，如果碳酸鹽濃度過高（如 23 mmol/L ), 則通入 5% C02 或置于 C02 孵箱中，用透氣性蓋子。

5. 24 h 后，從溫箱中取出第一次的 2 瓶細胞，計數細胞數：

(a) 將每瓶培養液完全吸掉；
(b) 每瓶加入 2 ml 胰蛋白酶/EDTA；
(c) 溫育培養瓶 15 min；
(d ) 用胰蛋白酶/EDTA 將細胞分離下來，取 0.4 ml 細胞懸液至 19.6 ml 的 D-PBSA 中以備計數；
(e) 用電子細胞計數儀計數細胞。

6 . 如第 5 步，在 4、8 和 72 h 時重復取樣。

7 . 于 72 h 時或者更早一些時間換培養液，這可依據 PH 的下降來決定（見方案 13.1 ; 彩圖 22b )。

8. 對于迅速生長的細胞（即 PDT 為 12～24 h 的細胞）可以每天連續取樣，但是對于生長緩慢的細胞（也就是 PDT > 24 h )，則每兩天取樣，直至細胞達到平臺期。

9 . 依據 pH 的改變，每 1、2 或 3 天換培養基。

10．于 2 、5、7、10 天取一個培養瓶染細胞（見 16.4.2 節）。

提示 也可以用血球計數板進行細胞計數，但這對于細胞濃度較低者尤其在生長曲線的開端比較困難。如果要用血球計數板，可將胰蛋白酶的容積減少至 0.5 ml，小心地用微吸管將細胞分散，使之不產生氣泡， 然后將細胞移至血球計數板。