1 使用管理
二氧化碳培養箱應由專人負責，設備的開關和調節旋扭一旦固定后，不要隨意扭動，以免影響箱內環境參數。箱子的放置要水平，避免陽光直射和灰塵等，要保證儀器周圍的氣流循環，后部及側面應留出5 cm的空隙。加入水箱的水必須是蒸餾水或無離子水，防止礦物質儲積在水箱內產生腐蝕作用。
2 溫度控制
培養箱溫度調整是依靠加熱管完成的，只能加熱升溫，如果室溫超過設定的溫度，培養箱內的溫度將超溫失控，室溫最少應低于箱內最低設定溫度5℃[5]，即如果箱內設定溫度為37℃，那么室溫不得高于32℃。
3 濕度控制
箱內濕度對于培養工作來說是一項非常重要然而又經常被忽略的因素。因為飽和濕度環境可以避免培養液中二氧化碳逃逸，培養液中pH值穩定，有利于細胞生長，足夠的濕度水平并且要有足夠快的濕度恢復速度（如在開關門后）才能保證不會由于過度干燥而導致培養失敗。所以二氧化碳培養箱使用過程中，在箱內托盤中放足夠的火菌水（3/2至全盤），使箱內成為飽和濕度環境。樣本多時，箱內分區存放，培養物用筐或瓷盤存放，這樣存取快速，縮短開門時間，減少箱內氣體和濕度變化，節省氣體，穩定了細胞生長環境。
4 二氧化碳輸入壓力控制
如果CO2探頭接觸CO2濃度過高會嚴重損害探頭，所以要嚴格控制CO2輸入壓力，規范更換氣瓶的操作，要熟悉減壓閥的功能及操作，即反時針關閉，順時針開啟，在每次更換氣瓶前必須將減壓閥反時針松開至游離狀態，安裝好氣瓶后再慢慢順時針加壓至0.06MPa。嚴格避免超壓情況發生。
5 污染控制
二氧化碳培養箱的污染分為生物性污染、化學性污染、物理性污染和氣溶膠污染[6]。使用前箱內應用消毒酒精或碘溶液徹底擦洗，防止其他微生物污染，另外三種污染以氣溶膠污染更為常見，需要加強生物安全操作相關的培訓，特別是進實驗室前的培訓，并且定期進行考核檢查是十分必要的。