2 qPCR與dPCR比較研究
qPCR是目前DNA定量研究的主要技術，該技術通過在PCR反應體系中加入熒光結合染料(SYBR
green I) 或熒光標記的探針( 如TaqMan Probes)
，利用實時積累的熒光信號監測整個擴增過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，以此來評估PCR的擴增效果。qPCR主要依賴于校準物制備的標準曲線，進而確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。該技術存在以下問題：a、校準品和樣品間背景的不同將引入偏差，并且影響PCR的效率和測量響應；b、低拷貝數的目標
DNA分子不能通過擴增檢測到；c、樣品的PCR擴增效率可能與校準物的擴增效率不同；d、DNA提取時引入DNA溶液的雜質或者DNA降解影響了PCR動態擴增過程。
dPCR是一項檢測和定量核酸的新技術。它不同于傳統的qPCR，因為采用直接計數目標分子數而不依靠任何校準物或外標，dPCR通過計數單個分子從而實現絕對定量。dPCR將傳統PCR的指數數據轉換成數字信號，僅僅通過顯示程序設定的循環數后擴增是否發生，即可克服上述困難，達到核酸的絕對定量。dPCR在進行擴增反應前，將含有DNA模板的PCR溶液稀釋后分布到大量的獨立反應室(圖2) ，單分子間通過稀釋分離，并且獨自進行PCR擴增，最后分析每個擴增產物。這實現了通過先于PCR擴增的樣品分離。這種樣品的分配可以消除本底信號的影響，提高低 豐度靶標的擴增靈敏度，簡單計算出DNA的模板拷貝數而不需要采用參考標準物或者外標。準確的定量依賴于40～45個循環的擴增，錯誤的陰性檢出水平(單DNA模板出現在反應室而未被檢出) 非常低。數字PCR是一項具有可重復性的定量微量DNA分子的優良技術。其操作方便、檢測通量高、特異性強、靈敏度高、定量準確等優點使其成為了分子生物學研究中的重要工具。
圖2 dPCR擴增反應原理
3 dPCR應用研究
3.1 dPCR在臨床診斷方面的研究
dPCR應用于癌癥的等位基因突變和拷貝數變異等方面的檢測研究，為癌癥檢測提供了新的診斷工具。Oehler
等對慢性白血病的相關基因ABL酪氨酸激酶結構域突變采用了dPCR進行絕對定量檢測，并且建立了同時檢測多個ABL酪氨酸激酶結構域突變的方法。表皮生長因子受體(
epithelial growth factor receptor ，EGFR) 突變或過表達一般會引發腫瘤。Yung
等開發了一種關于非小細胞性肺癌患者血漿和腫瘤中的兩種EGFR突變體( 第19外顯子內缺失和第21外顯子L858R 突變)
的dPCR定量檢測方法。第19外顯子內缺失和第21外顯子L858R突變占酪氨酸激酶突變響應的85%
以上。實驗結果表明這兩種突變在預治療的35個血漿樣品分別檢出6個(17%)和9個(26%)。與腫瘤細胞的測序結果相比，血漿EGFR突變的靈敏度和特異性是92%
和100%。在腫瘤和血漿中的低豐度EGFR突變通過微流體dPCR靈敏檢測和精確定量將應用于預測治療反應、監控疾病進展和早期檢測獲得性耐藥等方面研究。
高通量基因分型驗證與疾病相關的SNPs研究促使研究者采用一項新的技術，dPCR，對外周血液及口腔洗液提取DNA的基因分型進行評價分析。利用基于BioMark
PCR平臺的Fluidigm
48×48動態陣列生物芯片進行SNP基因分型。共90個樣品與20個SNP的體系對比，分別得到平均99.7%以及16個體系100%
的結果。TaqMan 基因分型與三組SNP進行對比得到了100%的相關性。為了研究DNA模板變化的影響，血液樣品(
CH-1，n=20；CH-2，n=47；KK，n=47)和口腔洗液( n=37) 通過24個SNPs 進行基因分型。CH-1 和CH-2
批次顯示了很好的基本響應(≥98.8%)，KK批次和口腔洗液樣品響應較低(82.1% 和94.0
%)。但經再純化后的KK和口腔洗液樣品結果響應率有顯著提高( 逸98.8% ).研究結果表明dPCR的準確度與TaqMan
基因分型類似，但DNA用量更少，節省了更多的人力、時間及成本。
拷貝數變異(copy number variation，CNV)
是人類遺傳變異的重要來源，并且與大量的人類疾病密切相關。Qin等采用dPCR
系統精確定量了DNA樣品的拷貝數，建立了dPCR的分析模型，并且進行了以下3個方面的研究：a、在一系列人類基因組和合成的RPP30基因中定量了RPP30基因的拷貝數，與預期結果相符；b、研究了商品化樣品中的CYP2D6基因拷貝數，與傳統手段定義的拷貝數一致；c、通過對ERBB2 基因的擴增篩選到了40個乳腺癌樣品，與文獻報道的基本一致。這項研究表明，dPCR為特異性CNV 的研究供了一個新的、精確的和強有力的技術支持。
孕婦血漿中的胎兒游離核酸(DNA和RNA檢測開啟了無創產前診斷的新領域，補充了唐氏綜合癥(非侵入性染色體異倍體) 產前診方法。基于胎兒核酸的精確dPCR方法推進了此研究領域的發展，為孕婦及胎兒提供更安全診斷。在2007年，Lo等在證明了dPCR 可用于孕婦血漿RNA- SNP等位基因比率的測量后，應用該方法從整倍體胎盤DNA 樣品中鑒別出21個三倍體樣品。Lo等進一步證明：即使三倍體DNA以小量片段存在時，異倍體也能被檢測到。后者對于針對母親血漿建立的三倍體檢測方式是十分必要的。Fan和Quake后續發表的文獻也支持了這個觀點。隨后，Lo等針對以蛋白質- RNA 復合物方式存在于血漿中的胎兒游離RNA進行了研究。比較了質譜和dPCR對孕婦血漿中PLAC4基因的mRNA-SNP比率，其中質譜的臨床靈敏度為90%，臨床特異性為96.5%，dPCR的臨床靈敏度和特異性均為100%。近期研究表明，與質譜檢測和qPCR相比，dPCR可以獲得更精確的定量結果。故此，dPCR檢測胎兒DNA的濃度可能要高于預期。微流體芯片dPCR的快速發展，已成為目前臨床應用最具潛力的無創產前診斷技術，并為其在常規檢查中的應用奠定了基礎。