在近年來所開發的一系列液相色譜方法中，溫度梯度淋洗方法有著獨特的應用，尤其是在要求以純水為流動相的色譜分析中。本文介紹了如何將已存在保留時間的模型發展成為溫度梯度淋洗的HPLC方法。
在高效液相色譜（HPLC）的方法開發中，原則上都是采用反復試驗法來建立的，實驗室用戶根據自己的經驗來改變一些參數以解決其色譜分離的問題，但是這一過程耗費大量時間和財力。HPLC梯度淋洗的原理已于1980年為Synder所提出，為此方法的開發利用了商業化的軟件程序例如Drylab 程序系統。借助這種軟件，可以將溶質的保留行為對各種色譜參數的依賴關系建立模型，通常是對梯度作用時間tG、溫度T，或者溶劑強度B的百分含量以及流動相的pH值同時進行優化。由能源和環境研究所與應用色譜Mornal研究所共同合作的項目，旨在將Synder提出的模型作進一步的發展。近年來，溫度參數在液相色譜中正顯得越來越重要，尤其是一系列要求用純水作為流動相的分析中。
圖2. 依附于柱內徑的模擬和實驗測得的保留時間的比較。
HPLC中的溫度梯度
為了將溫度作為高效液相色譜中的參數加以利用，必須滿足不同的前提。首先是需要一種高溫柱溫爐來控制流動相和固定相的溫度，這種裝置應該在流動相進入分離柱之前加以預熱。另一前提是，將流動相離開分離柱之后降低到確定的溫度。如此構想的加熱系統已通過與德國能源與環境研究所IUTA的合作開發成功，現在通過SIM公司以HT-HPLC-200柱溫爐的模型名稱銷售（見圖1）。這種模塊化構建的系統由淋洗液預熱部分、柱加熱部分和淋洗液冷卻部分組成，每一模塊均可單獨控制和編程，該加熱系統的工作范圍是30~200℃。此外，柱溫爐還能夠以30℃/min的速率加熱或冷卻，所以可于很短時間內冷卻到起始溫度。
另一前提，就是保證在高溫HPLC的例行加熱時固定相的溫度穩定性。當前僅有很少的商品分離柱具有這種足夠的溫度穩定性。除了多年來商業上提供的基于二氧化鈦和二氧化鋯這類金屬氧化物的分離柱之外，還有基于二氧化硅的合成材料可以應用，并在超過100℃的高溫下具有良好的溫度穩定性。其中Waters-BEH材料的溫度和pH穩定性尤為出眾。
圖3. 開發用純水分離磺胺類物質的方法時對 Drylab 軟件的抓圖。
目前的問題是，在液相色譜中，為什么必須應用溫度梯度？本文開頭已指出，一系列的聯合技術是基于應用純水作為流動相。為了使樣品中所含的物質都能夠被淋洗出來，在色譜進行的過程中淋洗液的強度必須予以提高。因為這里沒有其他溶劑梯度淋洗可用，惟一的可能性就是溫度梯度淋洗了。可是迄今為止還沒有任何一種軟件，能夠針對液相色譜中溶質與溫度的依賴關系建立模型。不過 Synder 工作小組已經指出，線性溶劑強度模型（LSS）能夠適合并成功地用于氣相色譜(GC)中編程的溫度梯度之中。這種用線性淋洗-強度模型（LES）來表示的模型現在就要應用到液相色譜的溫度梯度中。
結果與討論
與HPLC不同，在氣相色譜中僅僅采用溫度梯度模型。值得注意的是，在GC中應用溫度時，由于所用分離柱僅具有微小內徑，所以溫度的影響是直接的。在LC中則可以想到，由于分離柱的內徑在2.1~4.6mm之間，溫度對于置于柱溫爐中的柱子的影響會有一定的滯后。究其原因，是由于形成了徑向的溫度梯度。如果采用的加熱系統，其編程的溫度并不相應于分離柱的實際溫度，正如常用的空氣爐不帶溶劑預熱的情況那樣，則需要考慮到溶質的保留時間模型中依附于溫度的時間滯后問題。為查明這種滯后，直接測量柱床中的實際溫度也許很有意義，可是要在一種高壓系統中和溫度高達200℃的情況下要做到這點，從實驗的角度來看是難于實現的。在必須考慮這種與溫度有關的時間滯后作用時，也可以通過對溫度梯度的模擬來進行評估。為此應用了由6種類固醇所組成的混合物，采用純水流動相的溫度梯度的測定，在兩支具有不同內徑的Zirchrom PRD-分離柱上進行（Zirchrom PRD，150x3mm，5μm；Zirchrom PRD，100x1mm；3μm），這種柱材料由二氧化鋯加聚丁二烯鍍層而成。用于基線測量時選用的溫度范圍是60~160℃，溫度梯度提升率采用1.5、3.0、4.0 和6.0℃/min，然后溫度梯度提升率采用1.5和4.0℃/min，以便對帶有溫度梯度提升率3.0℃/min的色譜圖進行模擬，最后將這種模擬結果與利用不同內徑的兩種PRD-分離柱通過實驗測到的保留時間進行比較（見圖2）。可以看出，介于Drylab-模型與實驗結果的最大偏差值對于3mm內徑柱為13s，對于1mm內徑柱為23s，相對于總分析時間25min來說，這種偏差是很小的。在觀察相對誤差時亦是如此。在應用3 mm 內徑柱時，模擬的保留時間相對誤差為0.2%~ 1.3%，而應用1mm內徑柱時，模擬相對誤差為0.6% ~1.5%。這種偏差是如此之小，以致在模擬溫度梯度和利用SIM-HT-HPLC-200 高溫爐時不必考慮溫度引起的時間滯后問題。
圖4. 利用溫度梯度淋洗分離5種磺胺物質和尿嘧啶。
磺胺類藥物的分離
此處所描述的模擬模型的效率可以通過應用純水分離5種磺胺藥物的例子表現出來。首先在60~180℃的溫度范圍以2~6.0℃/min的梯度提升率測出兩條基線。然后將其保留數據置入Drylab 軟件中來進行方法開發。圖3是“梯度編輯器”在優化磺胺藥物分離時的抓屏圖。圖的上部窗口顯示帶有相應梯度點的編程的溫度梯度。用戶在進行方法開發時，可以根據相應規定，例如所要求的最低分離度對溫度梯度加以改動，圖的下部窗口顯示所分離的相應色譜圖。將上下對照就可以直觀地看出，溫度梯度曲線上的哪些改變可以影響溶質的分離。 圖4顯示在60~180℃、分析時間為12min時優化的純水-磺胺分離色譜圖（固定相：Waters Xbridge BEH C18，75×4.6mm，2.5μm；流動相：含0.1%甲酸的100%去離子水，流速：1.0 ml/min，注射體積：1μl；檢測：UV 270 nm；溫度梯度見圖4）。各種物質均為基線分離，介于磺胺嘧啶和磺胺噻唑之間的臨界分辨率達到3.4。為了顯示精密度，于表1中列出了由模擬和由實驗測得的保留時間的比較。介于模擬和實驗之間的偏差很小，其最大相對誤差僅為1.5%。除了精準地預測保留時間之外，還可以對預設的分離度進行模擬，這可應用前述模型來給定。相鄰兩峰（磺胺嘧啶和磺胺噻唑）之間的臨界分辨率以3.2%的相對誤差被精準地預測出來。
優化磺胺物質分離時采用模擬和根據實驗測得的保留時間的比較
總結與展望
本研究表明，在液相色譜中應用溫度梯度淋洗可以對保留時間和臨界分辨率進行準確預測。基于這樣的結果，Drylab 2010-HT 已在這種溫度梯度模型方面加以擴展。此外還表明，在應用SIM-HT-HPLC-200 柱溫爐于溫度梯度的模型計算時，不必考慮基于溫度的保留時間滯后的問題。因此，裝置加熱系統就能非常理想地適于液相色譜中的溫度梯度淋洗。
本研究計劃得到了聯邦經濟與技術部（BMWi）經由德國工業研究聯合會（AiF）項目編號為 KF 0087408 DA7的財政資助。
采用純水淋洗劑的反相色譜
基于用純水作淋洗劑的反相HPLC分離已由Morlar 和 Horvath 于1976 年所描述。這一在當時被稱為“純水反相色譜（NARP）”的分離技術，利用的是水在不斷增高的溫度下越來越趨于非極性這樣一種效應。由此可以對一些像類固醇這樣具有很強的非極性的物質進行分離，而不用附加任何改進劑到反相（RP）中進行分離。今天這一技術主要以高溫 HPLC 的概念而著稱，此時溫度所延伸的范圍大約是60~200℃。