19. 取 10 ml 反應混合物和分子質量參照物一起電泳，檢查預擴增的情況。 應該看到位于 50～500 bp 之間的，呈拖尾狀的彌散產物。
20. 按 1：500 稀釋 2 ul 非選擇性的預擴增cDNA片段（也就是＋0/＋0）到Tris· Cl （pH 8. 0）/0.1 mmol/L EDTA。
21. 在一個適合于 PE-9600 的熱循環儀的 PCR 板上準備選擇性預擴增反應（＋1/＋1）：
21.1 分裝 5 ul 1：500 的非選擇性預擴增 cDNA 片段到 PCR 板上的前兩列（1和2）的每一個孔中。
21.2 分裝 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 T 叫 TaqⅠ+A 到 A1 至 D1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+C 到 E1 至 H1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ＋G 到 A2 至 D2 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+T 到 E2 至 H2 的孔中。
21.3 分裝 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋A 到 A1、A2、E1 和 E2 中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋C 到 B1、B2、F1 和 F2 中，1.65 ul 的 8 pmol/ul 的引 物 MseI＋G 到 C1、C2、D1 和 D2 中，1.4 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseI＋T 到 D1、D2、H1 和 H2 中。
21.4 混合 32 ul 5 mmol/L dNTP， 80 ul 的 10× PCR 緩沖液 ，16 U 的 AmpliTaq-Gold 聚合酶，用水調整體積到 672 ul，配制成 dNTP/聚合酶混合液。
21.5 分裝 42 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前兩列的每個孔中。
22. 運行下面的降落： 溫度循環程序進行 AFLP 擴增：
13 輪：
30 s 94°C（變性）
30 s 65°C- 0.7°C/輪（引物復性）
60 s 72 0C （引物延伸）
20 輪：
30 s 94°C（變性）
30 s 56°C（引物復性）
60 s 72°C（引物延伸）
23. 準備下面的磷酸化反應混合物：
2.0 ul 10 uCi/ul （約 2000 Ci/mmol） ［33P-γ］ ATP
1.0 ul 10× T4 多核苷酸激酶緩沖液
4 U T4多核苷酸激酶
加水到 8 ul。
24. 混合 2.0 ul 8 pmol/ul 的選擇性引物（＋2）和 8 ul 的磷酸化反應混合物（步驟 23），磷酸化 16 pmol的選擇性 TaqI＋2 引物（20 個 AFLP 反應所需的量；也就是，對一個給定的 TagI＋2 引物，整套 256 種引物組合種所有 16＋2/＋2 的反應所需的量），產出的標記引物濃度為 12.6 pmol/ul， 終體積 10 ul。37°C 溫育 60 min，隨后 70°C 加熱 10 min 失活激酶。
25. 把 2 ul 各個預擴增產物（＋1/＋1；22 步）用 Tris·Cl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA 稀釋 500 倍。在一個適合于 PE-9600 的熱循環儀的 PCR 板上準備選擇性擴增反應（＋2/＋2）：
25.1 分裝 2 ul 1：500 的預擴增混合液 TaqI＋A/MseI＋C 到 PCR 板上的前兩列。
25.2 分裝 0.5 ul 標記的引物：TaqI＋AA 到 A1 至 D1 的孔中，0.5 ul 標記的引物 TaqI＋AC 到 E1 至 H1 的孔中，0.5 ul 標記的引物 TaqI＋AG 到 A2 至 D2 的孔中，0.5 ul 標記的引物 TaqI＋AT 到 E2 至 H2 的孔中。
25.3 分裝 0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CA 到 A1、A2、E1 和 E2 孔中，0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CC 到 B1、B2、F1 和 F2 孔中，0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CG 到 C1、C2、D1 和 D2 中，0.6 ul 未標記的引物 MseI＋CT 到 D1、D2、H1 和 H2 中。
25.4 混合 12.8 ul 5 mmol/L dNTP， 32 ul 的 10×PCR 緩沖液，6.4 U 的 AmpliTaq- Gold 聚合酶，用水調整體積到 270.4 ul， 配制成 dNTP/聚合酶混合液。
25.5 分裝 16.9 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前兩列的每個孔中。
26. 按照步驟 22 中的「降落」 PCR 程序擴增產物。
27. AFLP 反應中加入等體積（20 ul）的上樣緩沖液。90°C 加熱 3 min 變性 AFLP 反應產物，然后快速置于冰上冷卻。
28. 測序凝膠系統的后玻璃板用 2 ml 排斥型硅烷處理，前玻璃板用 10 ml 的黏合型硅烷處理。準備 4.5％ 的變性聚丙烯酰胺凝膠（約 100 ml）。
29. 用 1×TBE 作電泳緩沖液，上樣前預電泳 0.5 h， 使用合適的電泳條件使凝膠加熱到約 55°C （如對 BioRd 系統固定 110 W）。用溫度計監測凝膠的溫度。
30. 每孔上樣 3 ul（48 道的凝膠）或 1.5 ul（96 道的凝膠）的樣品，約 55°C 電泳分析。 如果需要的話，加上一個分子質量參照物（如 SequalMark 10-base 序列階梯）。
31. 電泳完成后，卸下凝膠。因為硅膠的處理，凝膠會黏附在前板上。凝膠浸泡在 10％ 的乙酸里 30 min 以固定凝膠。用水徹底淋洗凝膠，在通風櫥里室溫干燥 10～21 h， 或使用較高溫度 （如使用溫度浴）干燥較短時間直到凝膠不再發黏。
32. 放射自顯影或用磷屏顯示凝膠分離的 cDNA 片段。
收起
注意事項
1. 所有接觸RNA的溶液和材料必須是無RNase的，RNA的操作必須使用正確的操作技術。
2. 供應商和品牌一般不是十分重要，然而當遇到問題的時候，建議至少使用推薦商標的逆轉錄酶（SuperScript II）和 Taq 聚合酶（AmpliTaq 和 AmpliTaq-Gold）。
3. 當準備 AFLP 擴增的時候，建議盡可能使用混合好的試劑混合液。使用試劑混合液有助于配制反應，也非常有助于結果的可信度和重復性。在實際操作中，混合液的配制因實驗而定，即確定哪一個成分在一系列反應中是不變的：模板還是引物的組合（例如，一個樣品和許多不同的引物組合，許多樣品和一個引物組合）。
4. 甲酰胺是有害的，在通風櫥里進行這一步操作。
5. 放射性物質需要特殊的操作。
其他
1. 材料
Total RNA
2. 試劑
5' 生物素化的 dT25（5-生物素-dT25）
1× 和 2× 結合緩沖液 H2O： Milli-Q 純化的水（也就是經過五級Milli-QPhis系統處理的去離子水；Milipore）或雙蒸水
鏈霉親和素包被的磁珠（Dynal）
洗滌緩沖液
2 mmol/L EDTA，pH 7.5
5× 第一鏈緩沖液
5× 第二鏈緩沖液
0.1 mol/L DTT
5 和 10 mmol/L（每個）4 dNTP 的混合物（Amersham Pharmacia Biotech)
SuperScript II （Life Technologies）
E.coli DNA 連接酶（Life Technologies）
E.coli DNA 聚合酶 I （Pharmacia Biotech）
RNase H （Pharmacia Biotech）
1× 和 2×STEX
10 mmol/L Tris· Cl，pH 8. 0/0.1 mmol/L EDTA
TagI 限制性內切核酸酶（New England Biolabs）
5×RL緩沖液
MseI 限制性內切核酸酶（New England Biolabs）
50 pmol/ul 帶 TagI 黏性末端的連接子
750 pmol/ul 帶 Msd 黏性末端的連接子
10 mmol/L ATP （Amersham Pharmacia Biotech）
T4 DNA 連接酶（Amersham Pharmacia Biotech）
8 pmol/ul AFLP＋0 （非選擇性）引物（見寡核苷酸和雙鏈連接子的說明）：TaqI＋0 和 MwI＋0 引物
10×PCR 緩沖液
Ampli Taq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer）
10 uCi/ul （約 2000 Ci/mmol）［33P-γ］ATP （Amersham Pharmacia Biotech）
10× T4 多核苷酸激酶緩沖液
T4 多核昔酸激酶（Amersham Pharmacia Biotech）
8 pmol/ul AFLP+1 和 +2 （選擇性）引物（見寡核苷酸和雙鏈連接子的說明）： Ta9I+1 和 +2 和 MseI＋1 和＋2 引物
Ampli Taq-Gold 聚合酶
加樣染料
硅烷（Amersham Pharmacia Biotech）
黏合硅烷溶液，新配制：在 10 ml 的乙醇里混合 30 ul 的黏合硅烷（Amersham Pharmacia Biotech） 和 30 ul 冰醋酸
4.5％ 的變性聚丙烯酰胺凝膠
1× TBE 分子質量標準物（如 SequalMark 10-base ladder； Reserch Genetics；可選）
10％ （V/V）乙酸
3. 耗材
微量離心管，無 RNase
磁座（MPC； Dynal）
PE-9600 熱循環儀（Perkin-Elmer）和 PCR 板
測序凝膠系統（如 BioRad 38× 50× 0.04 cm SequiGen 測序凝膠系統）
磷屏（Fujix BAS 2000，Molecular Dynamics STORM 824）