Stefan Weidt,2 Bogusia Pesko,2 Cristian Cojocariu,1 Paul Silcock,1 Richard J. Burchmore,2 and Karl Burgess2
1Thermo Fisher Scienti_c, Runcorn, UK
2Glasgow Polyomics, University of Glasgow, Glasgow, UK
關鍵詞
法醫學；代謝組學；多變量統計分析；Q Exactive GC 系統
引言
代謝組學旨在表征和定量生物系統中的完整小分子代謝通路或代謝物組。代謝物組包含小分子多元混合物（包括氨基酸、糖和磷酸糖、生物胺和脂質）。非靶向代謝組學極具挑戰性，因為其要求定性和定量上百個不同種類化合物，而有關這些代謝物的經驗知識有限。因此，有必要使用一個既可以以非靶向的方式靈敏檢測特定分子，又可以提供精確質量數信息，用于確認未知物并對其進行結構解析的檢測系統。
氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）基于其自身的優點經常用于代謝組學分析，尤其是其色譜分辨率、重現性、峰容量和便于使用的質譜庫。GC為非靶向代謝組學中生物標志物的發現提供了卓越的色譜分離能力，但是，由于目前缺乏高端質譜儀的支持，從而限制了提供用于分析復雜樣品（例如，哺乳動物的肌肉組織）的動態范圍、精確質量數和掃描速度。鑒于大部分重要代謝物的極性特征，必須將其衍生化，以使其有效揮發，從而確保得到良好的色譜分離。代謝組學分析尤其是臨床代謝組學要求高通量和先進的自動化技術。
本項研究展示了新型 Thermo Scientific? Orbitrap? GC-MS 完整非靶向代謝組學工作流程，檢測了大鼠模型中的生物標記物，以判定其死亡時間。死亡時間（PMI）推斷是法醫調查中一項最關鍵也是最困難的任務，尤其當尸體溫度與周圍環境溫度達到平衡后。由于當前用于確定 PMI 的方法不精確性且以目視檢查尸體為主。因此，建立一種實驗方法，使用耐用生物標志物推斷死亡時間可輔助法醫調查。
該 GC-MS 裝置使用基于 Orbitrap 的檢測器，得到超高質量數分辨率、亞 ppm 質量數精度、寬動態范圍以及一定的掃描速度，用于有效定量極復雜代謝組學樣品。高分辨率、穩定的質量數精度和快速的掃描速度是進行穩定的數據解卷積的關鍵因素，以檢測重疊 TIC 峰中的化合物，進行非靶向代謝組學分析。電子轟擊電離（EI）裂解模式也適合基于應用廣泛的 NIST 庫和 Wiley 庫進行匹配，以識別化合物，同時為更深入的表征提供精確質量數。
儀器和方法設置
樣品制備
從各個大鼠腿部肌肉組織切片取樣，以時間順序增加進行尸檢及采樣。采用氯仿/甲醇/水（1:3:1）提取經勻質的組織切片中的代謝物，在冰塊下孵育 1 小時。蛋白質和 DNA 進行離心沉淀。去除上清液，貯藏在 -80 ℃ 條件下備用。
樣品衍生化
移取 200 μL 提取液至 1.5 mL 硼硅玻璃小瓶中，加蓋 9 mm 螺絲蓋。然后，將樣品置于 Thermo Scientific? Reacti-Vap? 蒸發器中，在 30 ℃ 條件下以低流速氮氣流干燥 60 min。以下所有衍生化步驟均采用 Thermo Scientific? TriPlus? RSH 自動樣品處理器進行。
加入 20 μL 20 mg/mL（w/v）甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液至每個干燥小瓶中。將小瓶渦旋 10 秒并在 30 ℃ 條件下孵育 60 min。甲氧基化步驟完成以后，加入 30 μL MSTFA +1% TMCS（N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺+1％三甲基氯硅烷）的混合液，進一步渦旋 30 秒。將小瓶置于 45 ℃ 條件下孵育 60 min 進行硅烷化。將樣品冷卻至室溫以備進樣。
GC-MS 分析
所有實驗均采用 Thermo Scientific? Q Exactive? GC 組合型四極桿 Orbitrap 質譜儀進行。采用 TriPlus RSH 自動進樣器進樣，采用 Thermo Scientific? TRACE? 1310 GC 色譜儀和 Thermo Scientific? TraceGOLD? TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm 薄膜毛細管柱（P/N: 26096-1301）進行色譜分離。儀器參數的其他詳細信息見表 1 和表 2。
表 1. GC 溫度程序
TRACE 1310 GC 參數 | |
進樣量（μL） | 1.0 |
襯管 | 單錐形（P/N 453A1345） |
入口（℃） | 250 |
入口模塊和模式 | SSL，分流 1:60 |
載氣（mL/min） | He，1.2 |
柱溫箱溫度程序 | |
溫度 1（℃） | 70 |
保持時間（min） | 2 |
溫度 2（℃） | 325 |
速度（℃/min） | 10 |
保持時間（min） | 8.5 |
表 2. 質譜儀參數
Q Exactive GC 質譜儀參數 | |
傳輸線（℃） | 275 |
電離類型 | EI |
離子源（℃） | 230 |
電離能量（eV） | 70 |
采集模式 | 全掃描 |
質量數范圍（m/z） | 50–750 |
質量數分辨率（m/z 200 時的 FWHM） | 60,000 |
質量數內標的質量數（m/z） | 207.03235 |
數據處理
數據分析流程首先使用 MSConvert（ProteoWizard 套件1的一部分）將原始數據文件轉換為 MzXML 文件。使用 XCMS 包2 和 centWave 算法提取峰。已檢測到的峰以 PeakML 格式輸出，然后使用 MzMatch.R 包對已檢測到的峰進行后處理（過濾每組重復進樣的最低檢測值、相對標準偏差和對 EI 碎片組進行分組的相關性匹配）。3生成的文本文件輸出使用 IDEOM 軟件4 進行單變量統計處理，使用 SIMCA? 13.0.35 進行多變量統計處理。使用 Thermo Scientific 解卷積軟件進行峰簇識別和解析。
結果和結論
將八只大鼠尸體置于室溫下四天。每日提取肌肉組織進行分析，共檢測 16 個樣品中代謝物濃度的變化以分析尸體分解程度。對樣品進行隨機分析以減小系統誤差。代謝組學優化后的分析流程見圖 1。
圖 1. Q Exactive GC 系統代謝組學研究的工作流程。以不同顏色顯示工作流程包中的任務分工：綠色用于生物技術人員；橙色用于實驗室技術人員；紫色用于儀器操作人員；藍色用于生物學信息處理人員。