差減克隆是分離和鑒定兩個細胞群中差異表達的 mRNA 的有效技術。相比較的細胞類型是［＋］（或 測 試）細胞和［-］（或驅動）細胞，在測試細胞中表達而不在驅動細胞中表達的 mRNA 將被分離出來。必需的差減次數主要取決于 cDNA 的多樣性。多樣性是指每一個細胞類型中不同的cDNA 或 cDNA 片段的總數（Davidson， 1986）。
| 實驗材料 | |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | ALuIRsaIATPT4 多聚核苷酸激酶及其緩沖液DNA連接酶和及其緩沖液Taq DNA聚合酶及其緩沖液寡核苷酸引物4dNTP 混合物驅動 dNTP 混合物轉化感受態菌株HEPES緩沖液鏈霉親和素溶液差減雜交緩沖液聚乙二醇 8000苯酚 氯仿氯仿礦物油乙醇MgCl2NaCl |
| 儀器、耗材 | 放射性標記的差減探針PCR 管微量離心管離子交換PCR離心柱Sephacryl S-300 離心柱離心機熱循環儀手提式蓋格計數器加熱塊 |
| 實驗步驟 | 實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 對每一組 ds cDNA （A 和 B）配制 2 個限制性內切核酸酶消化反應（AluI 和 AluI＋Rsal）： 30 ng ds cDNA 3 ul 10×AluI 緩沖液 10 U AluI 或 10 U AluI＋10 U RsaI 加水到 30.0 ul。 37℃ 溫育過夜，確保完全消化。 最好使用產生平端的酶。如果不是產生平端的酶，需要另外補平或削平。 2. 65℃溫育超過10 min失活內切酶。 3. 激酶處理寡核苷酸 a1 和 b1， 使用如下反應體系（每個反應體系 25 ul）： 18.0 ul H2O 2.5 ul 10 mmol/L ATP 2.5 ul 10×T4 多聚核苷酸激酶緩沖液 1.5 ul 3 ug/ul 的寡核苷酸 a1 或 b1 0.5 ul 10 U/ul T4多聚核苷酸激酶 37℃ 溫育 60 min。 4. 65℃溫育20 min失活激酶。 5. 加入 1.5 ul 的寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 形成 a1/a2 或 b1/b2 連接子。混勻，最高速離心。45℃ 溫育 10 min。 6.在 0.5 ml 的 PCR 管里，用合適的連接子為每組 cDNA 配制連接反應（130 ul 每個反應）： 63 ul H2O 13 ul 10× T4 DNA 連接酶緩沖液 30 ul 40％ PEG 8000 1ul 15 mmol/L ATP 10 ul AluI 消化的 cDNA 10 ul AluI/RsaI 消化的 cDNA 2 ul a1/a2 或 b1/b2 連接子 1ul 10 U/ul T4 DNA 連接酶 混勻，16℃溫育2 h。 7. 將反應管放于冰上超過10 min。 8. 根據廠家說明書準備 Sephacryl S-300 離心柱。 9. 每個連接反應中加入 1 ul 75 mmol/L 的 ATP 和 1 ul T4 多聚核苷酸激酶。37℃ 溫育 30 min。 10. 用 1 倍體積的 25：24 的苯酚/氯仿和氯仿依次抽提連接反應。 11. 連接產物離心過 Sephacryl S-300離心柱 ，除去未連接的連接子，用 Beckman Accuspin FR 離心機的吊桶轉子室溫，400 g 離心 2 min。 12. 兩組 cDNA ， 各配制 50 ul PCR反應體系： 35 ul H2O 5 ul 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液 3 ul 25 mmol/L MgCl2 1 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物 0.5 ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 5 ul 0.2 ng/ul 連接好的 cDNA A 或 cDNA B 0.5 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 加入幾滴無菌的 PCR 級的礦物油覆蓋反應體系。 13. 用下面的 PCR 程序擴增 cDNA ： 30 個循環： 1min 94℃ （變性） 1 min 50℃ （復性） 2 min 72℃ （延伸） 25 s 72℃ （自動延伸） 對于沒有自動延伸的熱循環儀，延長延伸時間為 2～4 min。 14. 用瓊脂糖凝膠電泳分析 5～10 ul 擴增好的 cDNA， 確定擴增 cDNA 的大小范圍 （150 bp～1. 5 kb， 大部分為 250 bp） 15. 對兩組擴增好的 cDNA， 各配制以下由放射性標記的測試 cDNA 的 PCR 反應體系 （每個反應體系 100 ul）： 77 ul H2O 10 ul 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液 6 ul 25 mmol/L MgCl2 2 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物 1 ul 稀釋的［32P］ dCTP 1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 2 ul A0 或 B0 cDNA （約 0.4 ug） 1 ul 5 U /ul Taq DNA 聚合酶 加入幾滴無菌的 PCR 級的礦物油覆蓋反應體系。 16. 對兩組擴增好的 cDNA， 各配制 3 或4 個由生物素標記的驅動 cDNA 的 PCR 反應體系（每個反應體系100 ul）： 73.3 ul H2O 10 ul 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液 6 ul 25 mmol/L MgCl2 6.7 ul 驅動 dNTP 1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 2 ul cDNA A0 或 cDNA B0 （1～５ ng） 1 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 加入幾滴無菌的 PCR 級礦物油覆蓋反應體系。 17. 用步驟 13 中的 PCR 擴增程序進行測試和驅動 cDNA 的合成。 18. 按廠家說明，用商業化的陰離子交換 PCR 離心柱（Qiagen）純化擴增的 cDNA，去除未摻入的核苷酸、引物和鹽。 19. 用分光光度計定量產物核酸。 20. 配制 2 個雜交反應（［32P］ An-Bio-Bn 和［32P］ Bn-Bio-An）。在一個 1.5 ml 硅烷化的微量離心管里，用乙醇沉淀 1 ug 放射性標記的測試 DNA 和 20 ug 的生物素標記的驅動 DNA，不要冷凍。風干沉淀，當沉淀剛剛干時，用吸頭輕輕吹吸，重新溶于 5 ul HEPES 緩沖液。用手提式蓋格計數器檢測重新溶解的核酸溶液。 21. 轉移重新溶解的 DNA 到一個 0.5 ml 的PCR管里。加入 5 ul 68℃ 的 2× 雜交緩沖液進行差減雜交。輕輕吹吸混勻，加入數滴無菌的 PCR 級的礦物油覆蓋 DNA 溶液。最高速離心幾秒。 22. 把兩個管子在 95℃加熱 10 min， 然后在 1 h 內慢慢冷卻到 68℃，并繼續在 68℃溫育 2 h （快速雜交）。 23. 混合 7 ul 1 mol/L的 NaCl 和 140 ul HEPES 緩沖液，加熱到 68℃。加入到雜交反應中稀釋反應。混勻，最高速簡單離心。冷卻到室溫。 24. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提前的總量計算）。 25. 每管中加入15 ul 鏈霉親和素，渦旋混勻，室溫溫育 5 min。 26. 每管用等體積的 25：24 的苯酚/氯仿抽提。保留水相轉移到新的管里。 27. 每管的水相中加入 10 ul 鏈霉親和素。混勻，室溫溫育 5 min。 28. 用苯酚/氯仿和氯仿各抽提兩次。測量每管的水相體積。 29. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提后的總量計算）。 被去除掉的測試cDNA的百分比用以下等式估算： ％ 去除的測試CDNA＝100 一（酚抽提后總量 ×100/釀抽提前總量） 30. 用 An 或 Bn 測試 cDNA 和合適的驅動 cDNA 重復差減的過程（步驟 15～29）。驅動 cDNA 的選擇由差減的策略決定。用 An 或 Bn 驅動 cDNA 進行快速雜交（2 h），用 A0 或 B0 驅動 cDNA 進行長時間雜交（30～40 h）。差減的進程用隙縫斑點雜交檢測。 31. 用步驟 13 的程序擴增 5 ul 差減 cDNA （An 和 Bn）。用一個商業化的陰離子交換 PCR 離心柱純化 PCR產物（如Qiagen）。 32. 用在連接子上有剪切位點的合適限制酶（針對于這里所用的連接子，如 Ec0RI 和 EcoRV）消化 cDNA。 33. 苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化消化的 cDNA。 34. 把 DNA 連接到合適的載體中（如 EcoRI 或 EcoRV 切開的 pBluescript）。 35. 轉化載體到感受態細菌里。 36. 鋪板培養差減文庫。 值得先通過滴定文庫以獲得單克隆。確定含插入片段克隆的百分比和插入片段的大小也很重要。 插入片段應當是 250 bp 左右。如果插入的片段 ＞500 bp， 則可以認為是插入了兩個片段。 37. 從每個起始濾膜制備 4 個重復的印跡。 38. 按照廠家說明，變性、中和和交聯印跡。 39. 用差減探針雜交這些重復的濾膜。 40. 從庫里隨機（如果估計庫里絕大多數是差異表達的基因）或按照探針的雜交結果挑取 50～100 個差異表達的克隆。準備小量的質粒 DNA。 41. 對每個質粒里的插入片段進行測序，把含有相同序列的克隆歸在一起。 42. 用起始組織的 RNA 分 析 ［如 Northern 印跡、 RNase 保護分析、定量 RT-PCR 或者原位雜交確定這些克隆是否確實是差異表達的。 |
| 注意事項 | |
| 其他 | 1. 材料 A 和 B 類細胞的雙鏈 cDNA （ds cDNA） 2. 試劑 ALuI 和 10×ALuI 緩沖液 RsaI 10、15 和 75 mmol/L 的 ATP 10 U/ul T4 多聚核苷酸激酶和 10×T4 多聚核苷酸激酶緩沖液 寡核苷酸引物 3 ug/ul a1： 5'-TAG TCC GAA TTC AAG CAA GAG CAC A-3’ 2.5 ug/ul a2： 5'-CTC TTG CTT GAA TTC GGA CTA-3' 3 ug/ul B1： 5'-ATG CTG GAT ATC TTG GTA CTC TTC A-3' 2.5 ug/ul B2： 5'-GAG TAC CAA GAT ATC CAG CAT-3’ 10 U/ul T4 DNA連接酶和 10×T4 DNA連接酶緩沖液 40％（m/V）聚乙二醇 8000（PEG 8000） 25：24（V/V）苯酚/氯仿（平衡酚配制） 氯仿 5 U/ul Taq DNA聚合酶和 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液 25 mmol/L MgCl2 10 mmol/L 4dNTP 混合物 礦物油，PCR級，無菌 800Ci/mmol ［α-32P］ dCTP （10 Ci/ul） 驅動 dNTP 混合物 乙醇 1 mol/L 和 5 mol/L NaCl HEPES緩沖液 2× 差減雜交緩沖液 鏈霉親和素溶液 EcoRI 和 10×EcoRI 緩沖液或 EcoRV 和 10× EcoRV 緩沖液 EcoRI 切開的 pBluescript 載體 EcoRV 切開的 pBluescript 載體 轉化感受態菌株 3. 耗材 放射性標記的差減探針 0.5 ml 的 PCR 管 Sephacryl S-300 離心柱（Amersham Pharmacia Biotech） Beckman Accuspin FR離心機和吊桶轉子或類似的其他離心機 熱循環儀 陰離子交換PCR離心柱（Qiagen） 1.5 ml微量離心管，硅烷化 手提式蓋格計數器 加熱塊 |