實驗方法原理
實驗材料 A 和 B 類細胞的雙鏈 cDNA （ds cDNA）
試劑、試劑盒 ALuIRsaIATPT4 多聚核苷酸激酶及其緩沖液DNA連接酶和及其緩沖液Taq DNA聚合酶及其緩沖液寡核苷酸引物4dNTP 混合物驅動 dNTP 混合物轉化感受態菌株HEPES緩沖液鏈霉親和素溶液差減雜交緩沖液聚乙二醇 8000苯酚 氯仿氯仿礦物油乙醇MgCl2NaCl
儀器、耗材 放射性標記的差減探針PCR 管微量離心管離子交換PCR離心柱Sephacryl S-300 離心柱離心機熱循環儀手提式蓋格計數器加熱塊
實驗步驟
實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」
1. 對每一組 ds cDNA （A 和 B）配制 2 個限制性內切核酸酶消化反應（AluI 和 AluI＋Rsal）：
30 ng ds cDNA
3 ul 10×AluI 緩沖液
10 U AluI 或 10 U AluI＋10 U RsaI
加水到 30.0 ul。
37℃ 溫育過夜，確保完全消化。
最好使用產生平端的酶。如果不是產生平端的酶，需要另外補平或削平。
2. 65℃溫育超過10 min失活內切酶。
3. 激酶處理寡核苷酸 a1 和 b1， 使用如下反應體系（每個反應體系 25 ul）：
18.0 ul H2O
2.5 ul 10 mmol/L ATP
2.5 ul 10×T4 多聚核苷酸激酶緩沖液
1.5 ul 3 ug/ul 的寡核苷酸 a1 或 b1
0.5 ul 10 U/ul T4多聚核苷酸激酶
37℃ 溫育 60 min。
4. 65℃溫育20 min失活激酶。
5. 加入 1.5 ul 的寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 形成 a1/a2 或 b1/b2 連接子。混勻，最高速離心。45℃ 溫育 10 min。
6.在 0.5 ml 的 PCR 管里，用合適的連接子為每組 cDNA 配制連接反應（130 ul 每個反應）：
63 ul H2O
13 ul 10× T4 DNA 連接酶緩沖液
30 ul 40％ PEG 8000
1ul 15 mmol/L ATP
10 ul AluI 消化的 cDNA
10 ul AluI/RsaI 消化的 cDNA
2 ul a1/a2 或 b1/b2 連接子
1ul 10 U/ul T4 DNA 連接酶
混勻，16℃溫育2 h。
7. 將反應管放于冰上超過10 min。
8. 根據廠家說明書準備 Sephacryl S-300 離心柱。
9. 每個連接反應中加入 1 ul 75 mmol/L 的 ATP 和 1 ul T4 多聚核苷酸激酶。37℃ 溫育 30 min。
10. 用 1 倍體積的 25：24 的苯酚/氯仿和氯仿依次抽提連接反應。
11. 連接產物離心過 Sephacryl S-300離心柱 ，除去未連接的連接子，用 Beckman Accuspin FR 離心機的吊桶轉子室溫，400 g 離心 2 min。
12. 兩組 cDNA ， 各配制 50 ul PCR反應體系：
35 ul H2O
5 ul 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液
3 ul 25 mmol/L MgCl2
1 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物
0.5 ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
5 ul 0.2 ng/ul 連接好的 cDNA A 或 cDNA B
0.5 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
加入幾滴無菌的 PCR 級的礦物油覆蓋反應體系。
13. 用下面的 PCR 程序擴增 cDNA ：
30 個循環：
1min 94℃ （變性）
1 min 50℃ （復性）
2 min 72℃ （延伸）
25 s 72℃ （自動延伸）
對于沒有自動延伸的熱循環儀，延長延伸時間為 2～4 min。
14. 用瓊脂糖凝膠電泳分析 5～10 ul 擴增好的 cDNA， 確定擴增 cDNA 的大小范圍 （150 bp～1. 5 kb， 大部分為 250 bp）
15. 對兩組擴增好的 cDNA， 各配制以下由放射性標記的測試 cDNA 的 PCR 反應體系 （每個反應體系 100 ul）：
77 ul H2O
10 ul 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液
6 ul 25 mmol/L MgCl2
2 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物
1 ul 稀釋的［32P］ dCTP
1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
2 ul A0 或 B0 cDNA （約 0.4 ug）
1 ul 5 U /ul Taq DNA 聚合酶
加入幾滴無菌的 PCR 級的礦物油覆蓋反應體系。
16. 對兩組擴增好的 cDNA， 各配制 3 或4 個由生物素標記的驅動 cDNA 的 PCR 反應體系（每個反應體系100 ul）：
73.3 ul H2O
10 ul 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液
6 ul 25 mmol/L MgCl2
6.7 ul 驅動 dNTP
1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
2 ul cDNA A0 或 cDNA B0 （1～５ ng）
1 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
加入幾滴無菌的 PCR 級礦物油覆蓋反應體系。
17. 用步驟 13 中的 PCR 擴增程序進行測試和驅動 cDNA 的合成。
18. 按廠家說明，用商業化的陰離子交換 PCR 離心柱（Qiagen）純化擴增的 cDNA，去除未摻入的核苷酸、引物和鹽。
19. 用分光光度計定量產物核酸。
20. 配制 2 個雜交反應（［32P］ An-Bio-Bn 和［32P］ Bn-Bio-An）。在一個 1.5 ml 硅烷化的微量離心管里，用乙醇沉淀 1 ug 放射性標記的測試 DNA 和 20 ug 的生物素標記的驅動 DNA，不要冷凍。風干沉淀，當沉淀剛剛干時，用吸頭輕輕吹吸，重新溶于 5 ul HEPES 緩沖液。用手提式蓋格計數器檢測重新溶解的核酸溶液。
21. 轉移重新溶解的 DNA 到一個 0.5 ml 的PCR管里。加入 5 ul 68℃ 的 2× 雜交緩沖液進行差減雜交。輕輕吹吸混勻，加入數滴無菌的 PCR 級的礦物油覆蓋 DNA 溶液。最高速離心幾秒。
22. 把兩個管子在 95℃加熱 10 min， 然后在 1 h 內慢慢冷卻到 68℃，并繼續在 68℃溫育 2 h （快速雜交）。
23. 混合 7 ul 1 mol/L的 NaCl 和 140 ul HEPES 緩沖液，加熱到 68℃。加入到雜交反應中稀釋反應。混勻，最高速簡單離心。冷卻到室溫。
24. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提前的總量計算）。
25. 每管中加入15 ul 鏈霉親和素，渦旋混勻，室溫溫育 5 min。
26. 每管用等體積的 25：24 的苯酚/氯仿抽提。保留水相轉移到新的管里。
27. 每管的水相中加入 10 ul 鏈霉親和素。混勻，室溫溫育 5 min。
28. 用苯酚/氯仿和氯仿各抽提兩次。測量每管的水相體積。
29. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提后的總量計算）。
被去除掉的測試cDNA的百分比用以下等式估算：
％ 去除的測試CDNA＝100 一（酚抽提后總量 ×100/釀抽提前總量）
30. 用 An 或 Bn 測試 cDNA 和合適的驅動 cDNA 重復差減的過程（步驟 15～29）。驅動 cDNA 的選擇由差減的策略決定。用 An 或 Bn 驅動 cDNA 進行快速雜交（2 h），用 A0 或 B0 驅動 cDNA 進行長時間雜交（30～40 h）。差減的進程用隙縫斑點雜交檢測。
31. 用步驟 13 的程序擴增 5 ul 差減 cDNA （An 和 Bn）。用一個商業化的陰離子交換 PCR 離心柱純化 PCR產物（如Qiagen）。
32. 用在連接子上有剪切位點的合適限制酶（針對于這里所用的連接子，如 Ec0RI 和 EcoRV）消化 cDNA。
33. 苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化消化的 cDNA。
34. 把 DNA 連接到合適的載體中（如 EcoRI 或 EcoRV 切開的 pBluescript）。
35. 轉化載體到感受態細菌里。
36. 鋪板培養差減文庫。
值得先通過滴定文庫以獲得單克隆。確定含插入片段克隆的百分比和插入片段的大小也很重要。
插入片段應當是 250 bp 左右。如果插入的片段 ＞500 bp， 則可以認為是插入了兩個片段。
37. 從每個起始濾膜制備 4 個重復的印跡。
38. 按照廠家說明，變性、中和和交聯印跡。
39. 用差減探針雜交這些重復的濾膜。
40. 從庫里隨機（如果估計庫里絕大多數是差異表達的基因）或按照探針的雜交結果挑取 50～100 個差異表達的克隆。準備小量的質粒 DNA。
41. 對每個質粒里的插入片段進行測序，把含有相同序列的克隆歸在一起。
42. 用起始組織的 RNA 分 析 ［如 Northern 印跡、 RNase 保護分析、定量 RT-PCR 或者原位雜交確定這些克隆是否確實是差異表達的。
收起
注意事項
其他
1. 材料
A 和 B 類細胞的雙鏈 cDNA （ds cDNA）
2. 試劑
ALuI 和 10×ALuI 緩沖液
RsaI
10、15 和 75 mmol/L 的 ATP
10 U/ul T4 多聚核苷酸激酶和 10×T4 多聚核苷酸激酶緩沖液
寡核苷酸引物
3 ug/ul a1： 5'-TAG TCC GAA TTC AAG CAA GAG CAC A-3’
2.5 ug/ul a2： 5'-CTC TTG CTT GAA TTC GGA CTA-3'
3 ug/ul B1： 5'-ATG CTG GAT ATC TTG GTA CTC TTC A-3'
2.5 ug/ul B2： 5'-GAG TAC CAA GAT ATC CAG CAT-3’
10 U/ul T4 DNA連接酶和 10×T4 DNA連接酶緩沖液
40％（m/V）聚乙二醇 8000（PEG 8000）
25：24（V/V）苯酚/氯仿（平衡酚配制）
氯仿
5 U/ul Taq DNA聚合酶和 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液
25 mmol/L MgCl2
10 mmol/L 4dNTP 混合物
礦物油，PCR級，無菌
800Ci/mmol ［α-32P］ dCTP （10 Ci/ul）
驅動 dNTP 混合物
乙醇
1 mol/L 和 5 mol/L NaCl
HEPES緩沖液
2× 差減雜交緩沖液
鏈霉親和素溶液
EcoRI 和 10×EcoRI 緩沖液或 EcoRV 和 10× EcoRV 緩沖液
EcoRI 切開的 pBluescript 載體
EcoRV 切開的 pBluescript 載體
轉化感受態菌株
3. 耗材
放射性標記的差減探針
0.5 ml 的 PCR 管
Sephacryl S-300 離心柱（Amersham Pharmacia Biotech）
Beckman Accuspin FR離心機和吊桶轉子或類似的其他離心機
熱循環儀
陰離子交換PCR離心柱（Qiagen）
1.5 ml微量離心管，硅烷化
手提式蓋格計數器
加熱塊