前沿
相對于過去常用的腫瘤細胞接種和免疫缺陷小鼠模型，基因修飾小鼠（GEM）模型是建立在天然完整免疫條件下的原發（de novo）腫瘤。因此，作為腫瘤學研究的工具，GEM模型更能模擬人腫瘤的組織病理學和分子學特征，表現為有更好的遺傳異質性，其優勢在于能反映腫瘤細胞自身，以及腫瘤微環境中細胞等相互作用因素，包括具有引起原發腫瘤開始形成到發展為轉移性疾病的能力。GEM模型的建立及應用極大促進了腫瘤學研究領域的發展與進步。目前，GEM模型已成功應用于驗證潛在腫瘤基因與藥物靶點，考核治療效果，分析腫瘤微環境影響，以及評價藥物耐藥性機制等研究領域。而且，結合臨床病人研究與構建更加合理有效的GEM模型，優化腫瘤干預的臨床前試驗，無疑將進一步促進腫瘤治療新策略的研發，提高其有效轉化為臨床上實際應用的成功率。
目前腫瘤學研究面臨的主要挑戰
腫瘤學研究及腫瘤治療在臨床上仍然面臨著許多挑戰，其中抗腫瘤藥物耐受性的形成和腫瘤轉移性疾病是當前面臨的兩個重要現實難題。抗腫瘤耐藥性的產生是由于異質性腫瘤中的原發突變的出現，或治療前耐藥克隆的大量生長引起的，而現有靶向抗腫瘤制劑的單一療法，或化學藥物療法都無法避免藥物耐受的發生。而且，在獲得明顯成功治療之后，少量藥物耐受腫瘤細胞可以存活下來，并在一定時間后，成為主要細胞群，最終形成與原始腫瘤表型不同的復發疾病。而腫瘤轉移性疾病則是導致90%以上與癌癥相關死亡的原因，因為現在對于這些繼發腫瘤也多無有效的治療方法。近年來，雖然針對干預腫瘤病人免疫系統的腫瘤免疫療法取得了一些令人鼓舞的進展，但該療法也只是在一些特定病例情況下有效果，而對于大多數腫瘤病人仍不具有實際臨床意義。
所謂成功的腫瘤治療往往需要多種方法的協同作用，比如手術，放射線照射，細胞毒性療法，以及免疫療法等綜合策略。為了設計出有效合理的綜合治療措施與方案，首要的基礎與前提是深入了解腫瘤的形成與發展，轉移，及治療應答過程中，腫瘤細胞自身及其微環境細胞間相互作用的機制，從而尋找針對不同腫瘤類型最有效的治療方法。為了實現這一目的，研究者們就必須依賴于動物模型的臨床前研究。盡管過去依賴于傳統臨床前小鼠模型（即通過建立移植人腫瘤細胞系或同種小鼠腫瘤細胞系模型等方法）獲得了臨床前抗癌新療法的成功驗證，但絕大多數的這些新療法在臨床III期試驗中卻都以失敗而告終。
總體上講，由于傳統體內腫瘤小鼠模型在預測臨床新療法效果方面的表現不佳，因而更加凸顯出尋找具有更好預測能力及效果的改進型臨床前體內模型的意義與價值。最近在基因修飾技術方面的進步與發展，使得快速研制能更有效模擬人腫瘤的GEM模型成為現實，GEM模型在遺傳組成，腫瘤細胞與其腫瘤微環境的相互作用，藥物反應及耐受等方面都更接近腫瘤病人。而新一代GEM模型的出現，也大大促進抗腫瘤新療法策略轉化為臨床應用，最終達到提高癌癥病人生存率的目的。
腫瘤學研究中常用傳統小鼠模型的優勢與不足
50年前首先在裸鼠體內移植人/鼠腫瘤細胞系而建立的小鼠腫瘤移植模型成為腫瘤研究中常用的小鼠模型，這類移植模型可快速測試潛在腫瘤及轉移相關基因，并成為臨床前的藥物試驗主要工具。例如，通過異種移植研究有助于揭示結腸癌（CRC）對藥物（如Vemurafenib）在小鼠體內的耐受機制，從而實現在臨床試驗中對CRC病人啟動同時針對突變BRAF（如V600E）和EGFR的靶向聯合療法，表明這類異種移植模型在建立新的聯合治療策略方面的實際意義。
異種移植研究也有助于發現特定基因表達特征，研究其介導的器官特異性定位轉移的特點。如應用該種模型證實了傳播的乳腺癌細胞存在于血管附近，這為調控這些傳播的乳腺癌細胞提供了可能的對策。而且，應用腫瘤細胞系移植的體內模型研究，也為抗腫瘤免疫，T細胞耐受機制，腫瘤免疫逃逸途徑等提供了許多基本的認識概念。這些發現都為目前進行中的腫瘤免疫療法的突破奠定了基礎。
然而，由于腫瘤細胞系一開始就含有許多突變，而且在體外長時間培養過程中，還會產生額外突變，因此，此類接種模型難以真實反映人腫瘤細胞的形態學和遺傳異質性，從而降低了該類模型作為臨床應用效果預測性的可靠性。另外，為了防止可能的排斥反應，腫瘤細胞系的異種移植模型是建立在免疫缺陷小鼠基礎上，這也限制了其應用于腫瘤發展中免疫系統以及治療應答等領域的研究。
不同于細胞系移植模型，通過將新鮮人腫瘤活檢物移植至免疫缺陷小鼠構建的病人來源的腫瘤移植（Patient-derived tumor xenografts，PDTX，或PDX）模型則具有更多優勢，PDX小鼠模型的腫瘤保留了來自腫瘤病人的腫瘤組織分子，遺傳，組織學異質性等特征（甚至經過小鼠體內的傳代幾代之后）。所以，PDX模型也成為目前個性化醫學和臨床前藥物篩選的有用工具。
目前，PDX模型的研究已大規模應用于潛在臨床藥物預測試驗。有研究者通過構建約1000個來自不同類型突變的PDX模型，并應用這些不同的PDX模型對不同藥物進行小鼠體內篩選，尋找藥物與腫瘤基因型之間的關聯性，以達到試驗重復性和臨床可解釋性的統一。
不幸的是，PDX模型在研究某些類型腫瘤方面（如雌激素受體陽性的乳腺癌和前列腺癌）的不滿意效果成為了限制其應用的主要障礙。而且，PDX模型必須建立在免疫缺陷小鼠上，這樣的小鼠缺乏由獲得性免疫系統介導的天然抗腫瘤與促腫瘤活動。
研究者們也明白，雖然PDX模型缺乏功能性的獲得性免疫系統，該模型仍可為臨床提供有價值的研究資料。正在進行中的相應改進是通過移植人CD34陽性造血干細胞或前體細胞的方法，重建人免疫系統的人源化的小鼠模型，并取得了顯著的成功。雖然來自某些特異譜系的人免疫細胞在小鼠體內的重建仍具有挑戰性，但通過引入人相關細胞因子，趨化因子，生長因子等方式，獲得促進人骨髓細胞在小鼠體內發育與成熟的效果。
為了構建優化能夠支持人HLA限制性T細胞發育的免疫缺陷小鼠，應用基因修飾技術建立人源化小鼠模型，將人HLA分子引入至敲除小鼠MHC類型I和II相應區域。人源化小鼠模型能作為免疫療法臨床前評價的有用工具，然而，當人造血干細胞供體來源（如通過臍帶血或胎肝）有限時，其現實操作中的較高構建成本也自然成為該模型實際應用的不利因素了。
應用不斷完善GEM模型研究原發腫瘤
上世紀70年代成功建立小鼠原核注射轉基因技術以后，1980年早期借助該方法第一次將克隆癌基因導入小鼠基因組中，成功制備了所謂的致癌小鼠（Oncomice）。 該致癌小鼠是應用乳腺特異性起動子（MMTV）特異性表達癌基因v-HRas的第一個腫瘤GEM模型，該致癌小鼠首次構建成功，證實了該小鼠形成原發乳腺腫瘤，并極大地振奮了腫瘤研究領域團體，因為此研究結果第一次真正證明了癌基因在正常細胞中表達能產生腫瘤的假說。1992年伴隨著小鼠胚胎干細胞（ES）基因打靶技術的突破發展，成功構建的腫瘤抑制基因（TSG）敲除小鼠，也證明了該類TSG基因在腫瘤發生過程中的重要作用。
雖然致癌小鼠和TSG敲除小鼠提供了非常有價值的理論依據，但這兩種模型也存在其局限性。由于轉基因技術獲得的小鼠是使轉入的外源基因表達在特定組織中所有的細胞，TSG敲除小鼠則是滅活體內所有細胞中的相關基因。然而，現實腫瘤的形成過程是在個體中整個組織器官健康的前提下，由于某個單細胞中某種遺傳變異的積累而導致的彌散腫瘤現象。為了符合腫瘤形成過程的實際情況，更有必要設計與構建更加合理或復雜的小鼠模型，比如能實現條件性的在體細胞滅活腫瘤抑制基因，或者激活（突變）致癌基因的所謂條件性GEM模型。條件性GEM模型構建的基本原理是將需要修飾基因兩端分別加上loxP重組位點，在特定Cre重組酶存在的情況下，loxP兩端之間的DNA就可被敲除，達到特定條件下滅活該基因的目的。應用這種模型的第一個成功的例子是應用Cre-loxP系統介導的體細胞滅活Apc基因而構建的小鼠結直腸癌模型。應用腺病毒載體實現Cre重組酶特異性表達于腸上皮細胞，組織特異性敲除APC基因，引起小鼠快速形成散在結直腸腺瘤，其特征與家族性結腸腺瘤性息肉病（FAP）病人有許多相似性。所以，通過發現特異性相關癌癥基因的突變體，研究者們可構建在組織學、分子學以及臨床上更能模擬腫瘤病人的相似特征的小鼠模型。
借助Cre-ERT融合蛋白誘導系統，研究者們可對體細胞中相關靶基因在特定時間與特定組織實施修飾，即將雌激素受體的突變激素結合區域與Cre重組酶融合在一起，建立可誘導調控的Cre重組酶表達系統，當在雌激素類似物（如Tamoxifen）存在的情況下，引起Cre重組酶活性在翻譯后激活，發揮其識別loxP位點的作用，實現誘導性切割靶基因的目的。因此，LoxP小鼠（即靶基因DNA兩端分別含loxP位點）的條件性基因修飾，通過在選擇的時間里加入誘導劑Tamoxifen后，控制Cre-ERT的特異性表達，達到對靶基因進行時空與區域上特定修飾的目的。
雖然Cre-loxP系統能用于多于一個基因的修飾，但因這種過程是同時發生的，所以難以完全模擬腫瘤多步驟形成過程中，突變是逐漸積累形成過程的特征。最近，研究者們利用可獨立發揮作用的可誘導雙重組酶系統（如Flp-FRT/Cre-loxP，或Cre-loxP/Dre-rox），建立了對靶基因表達實施先后調控的修飾方式。該技術方法成功應用的實際意義有如下幾方面，1. 獨立研究針對腫瘤細胞的自發和非自發通路及過程；2. 模擬人多步驟的癌癥形成過程，有續地進行誘導突變；3. 開展獨特的腫瘤治療靶點遺傳性評價。
腫瘤GEM模型構建策略與技術方面的改進
GEM模型因其獨特優勢已經被證實是腫瘤學研究的有效工具，但研究者們也一直努力對其進行著不斷改進與完善。該類小鼠模型由于在構建與研制過程中周期長，工作量大，以及成本高等原因，特別是對于多個等位遺傳位點進行修飾，構建具有遺傳特性的新突變小鼠模型，研制過程更耗時，且需要更長久的交配繁殖過程。這也成為限制具有遺傳能力的GEM模型廣泛實際應用的一個主要因素。近年來，由于腫瘤基因組序列研究技術的廣泛普及與應用，以及隨著新發現的癌癥相關基因突變數量的快速增長，更加需要建立快速新穎的小鼠模型研制策略，實現在體內快速驗證潛在致癌基因，以及建立已知病人相關突變的非生殖遺傳修飾GEM模型的目的。目前這方面的進展主要有：ES細胞為基礎的腫瘤模型；應用CRISPR/Cas9技術基因組編程；腫瘤病人相關位點的改善腫瘤模型。
1. ES細胞為基礎的腫瘤模型
為了進一步加快新型人腫瘤GEM模型的研制，將小鼠胚胎干細胞（ESC）經過基因修飾后而作為非遺傳修飾（如嵌合體）小鼠直接進行腫瘤學研究已成為一種研究策略。最近報道的GEM-ESC策略，即建立以ES細胞為基礎的腫瘤GEM模型。該類模型是在原有基因修飾的基礎上，快速構建新型基因遺傳修飾小鼠模型。例如，應用GEM-ESC策略，在原有K14cre-Brca1-Trp53(KBIP)的小鼠乳腺腫瘤模型的ESC上，直接導入MET原癌基因，構建新型KBIP-MET的轉化乳腺癌模型。研究結果表明，與KBIP小鼠相比，此KBIP-MET小鼠形成的乳腺癌更具有轉化特征，表現為更容易形成癌肉瘤。在對腫瘤藥物的反應性上，KBIP小鼠模型的乳腺癌對臨床RARP抑制劑（如Olaparib）敏感，而KBIP-MET小鼠模型的轉化乳腺腫瘤則顯示對該抑制劑具有耐受性。
2. 應用CRISPR/Cas9技術的基因組編程
過去十年，伴隨新的基因組編程技術（如ZFNs和TALENs）快速發展，2013年出現CRISPR/Cas9基因組編程系統，該類基因組編輯技術成為繼PCR技術發展以來，過去幾年生物學研究領域的有革命性進步的及影響力最大的技術更新。CRISPR/Cas9系統首先發現于原核生物中針對抵抗外來入侵遺傳物質而建立的免疫系統，并很快被成功用于各類物種的基因編輯。借助單一的引導RNA（sgRNAs)，Cas9核酸酶成為能特異性作用于基因組任何基因位點，達到基因敲除的目的。通過應用Cas9誘導的DNA斷裂和單鏈核苷酸/供體DNA，該系統也可實現對特定基因突變，或特定插入loxP/FRT重組位點等進行遺傳修飾。
CRISPR/Cas9技術系統所表現出的同時對基因組不同位點進行有效編輯等基因打靶策略特征，使其立刻成為快速研制腫瘤小鼠模型的最佳選擇。目前在人腫瘤病人觀察的所有遺傳突變都可以通過基因修飾的方法來快速地構建相應的小鼠模型，包括條件性基因敲除，點突變，易位等。另外，也有研究者應用CRISPR/Cas9技術對小鼠的致癌基因和TSGs進行了體細胞（非生殖遺傳性）編輯，因為此研究策略的努力與成功，使該系統成為研制肝細胞腫瘤，肺癌，腦癌，胰腺癌，以及乳腺癌的非遺傳修飾模型的新方法。