基因克隆常見方法

、T4連接酶介導的DNA克隆

傳統的分子克隆，通常需要使用相同的限制性內切酶酶切載體和目的片段，使得載體和片段產生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA連接酶對其進行連接，轉化，挑取陽性克隆，得到重組質粒

為了更方便的對DNA進行克隆，后續又將克隆的載體進行了簡化，出現了T載體，這樣就可以不用酶切，直接將片段連接到載體上，以便于DNA的保存及后續擴增。

以TA克隆為例來介紹整個連接過程。常規的連接是一個三分子共同反應的過程（圖1），載體、片段和連接酶碰撞在一起，發生反應，完成連接過程。為了得到更多的陽性克隆，我們會傾向于加入更多的片段、載體和連接酶，以提高分子碰撞機率，但同時也會遇到一個問題，過高的DNA濃度和T4連接酶濃度會增加分子間相互作用促進串聯體和載體自連的形成，反而導致片段和酶的利用率降低。所以在進行TA克隆時，并不是DNA和酶加入的越多越好。

使用這種方法進行克隆，如果需要連接平末端的DNA片段（比如Pfu類酶擴增的片段），則需要進行額外的加A尾反應（可以使用Taq酶完成加A）

二、EASY克隆

EASY克隆的方法主要依賴于載體上所攜帶的拓撲異構酶。拓撲異構酶的生理作用主要體現在DNA復制的過程中，同時具有內切酶和連接酶的功能：酶切釋放DNA復制過程中產生的螺旋力；在復制完成后，將缺口補上，完成DNA的復制。很多拓撲異構酶無明顯特異性結合DNA序列的規律，直到1990年，科學家舒曼在牛痘病毒中發現了一種拓撲異構酶能特異性識別C/TCCTT序列（圖2），并對后面序列進行切割和連接，才使得拓撲異構酶用于DNA克隆成為可能。

圖2 左圖：拓撲異構酶識別特定的序列；右圖：拓撲異構酶介導的基因克隆

EASY克隆就是基于這一原理，將T堿基通過磷酸鍵與拓撲異構酶第274位酪氨酸結合，使拓撲異構酶和載體偶聯在