基因克隆技術是分子生物學的核心技術，其目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，用于深入分析基因的結構與功能，并可達到人為改造細胞以及物種遺傳性狀的目的。基因克隆的一項關鍵技術是DNA重組技術，它利用酶學方法將不同來源的DNA分子進行體外特異性切割，重新拼接組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上將雜合DNA分子轉入一定宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程稱基因克隆。有目的地通過基因克隆技術，人為操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程總稱為基因工程。
基因克隆的一般程序為：
一、獲取目的基因
目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。獲取目的基因的主要方法：
1、用限制性內切酶酶解染色體DNA，構建基因組文庫，再從基因組文庫中篩選目的基因。該法的優點是獲得的目的基因的組織結構與天然基因完全相同，在結構基因中也含有內含子序列，但是也正因為這一點構成了該法最大缺點，即含有內含子的基因在原核細胞中不能表達。原因是原核細胞不能識別并剪切插入順序(內含子)，因而也不能表達出正確的基因產物。
2、分離純化細胞中的mRNA，以mRNA為模板，在反轉錄酶作用下生成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板在DNA聚合酶作用下生成雙鏈cDNA,構建cDNA文庫，從中篩選所需的目的基因。此法僅用于篩選為蛋白質編碼的結構基因。因成熟的mRNA分子中已經切除了內含子序列，具有完整的閱讀框架，可在原核細胞中正確表達。
3、人工體外合成基因：由于當前人工體外合成DNA的長度有限，此法僅用于制備小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因較大情況下，常需先合成多個DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法還要求目的基因的全部堿基順序已被闡明。
4、PCR法擴增基因：PCR(聚合酶鏈式反應)技術的出現和發展，為目的基因的尋找提供了有力技術工具。用PCR法可選擇性擴增基因組中所要研究的個別基因或DNA片段，或用反向PCR技術，先將特定mRNA反轉錄為cDNA第一鏈，然后再進行擴增。用PCR法篩選基因，需要對目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、選擇適當的載體
按上述方法制備的目的基因如果沒有合適的載體協助，很難進入受體細胞，即使能進入，往往也不能進行復制和表達，因為這些外源性DNA一般不帶有復制調控系統。為了保證目的基因或外源DNA片段能在細胞內克隆，必須將它們與適當的載體連接。理想的載體應該是：(1)分子量較小，能在細胞內自主復制的環狀或線狀DNA分子；(2)具有特異的限制性酶切位點，便于外源DNA片段的插入，且有明顯的遺傳篩選標志，如抗藥性或插入失活等，以利于陽性克隆的篩選；(4)具有生物安全性。常用的克隆載體可分為三類，即質粒、噬菌體及病毒。由于天然載體用于基因克隆存在許多缺點，現用載體實際上是在天然載體基礎上進行改造而成。
1、質粒載體
質粒是細菌染色體外小型環狀DNA復制子，質粒載體是在天然質粒的基礎上人工改造拼接而成。質粒載體具有如下特點：分子相對較小(3~10kb)；含松弛型復制子因而在宿主細胞的拷貝數高；在復制子外適當位置有由多個單一內切酶位點組成的多克隆區，極有利于外源DNA片段的插入；具有抗藥性及插入失活標記，可以從平板中直接篩選陽性重組子。但由于質粒分子太小，只能接受小于15kb的外源DNA片段的插入。因此，插入片段過大，會導致重組子擴增速度減慢甚至插入片段丟失。
2、噬菌體載體
目前使用的噬菌體載體主要有λ噬菌體、Cosmid及M13噬菌體等。λ噬菌體是一種能感染大腸桿菌的病毒，其基因組為線狀雙鏈DNA分子。在λ噬菌體DNA(λDNA)的中間1/3處，是可被替換而不影響噬菌體生長的“非生活區”，此區的DNA可通過遺傳工程技術由外來DNA片段所替代。λDNA作為載體的優點是：在體外可包裝成病毒顆粒高效地感染大腸桿菌；載體容量大，可將23~25kb的外源DNA片段引入其內；篩選和保存較為方便。
M13也是大腸桿菌噬菌體，其基因組為單鏈線性DNA分子。感染大腸桿菌后，此單鏈DNA轉變為復制型雙鏈DNA。克隆復制后，仍以單鏈形式包裝成新的噬菌體釋放到介質中。M13DNA分子中有一長507個核苷酸的小“非生活區”可以被外來DNA片段取代。M13載體的主要優點是重組的M13DNA仍為單鏈結構，所以能方便地用于Sanger雙脫氧法測定所克隆DNA片段的序列，或用于合成RNA探針的模板。M13載體的主要問題是容量太小，當插入片段大于1000個核苷酸時就很不穩定，容易在增殖的過程中丟失。
Cosmid載體從結構上看成是一種人工構建的雜種載體，由噬菌體DNA和質粒DNA的某些功能片段拼接而成，其轉染細胞及病毒顆粒包裝與λDNA相似，但在細胞內的復制則與質粒相同。與λDNA相比，Cosmid的主要優點是載體容量很大，插入DNA片段的長度可高達45kb。
三、構建重組體
DNA體外重組是將目的基因在DNA連接酶作用下，連接到合適的載體DNA上，以便下一步轉化之用。這種由兩種不同DNA片段重新組合而成的DNA稱重組DNA，簡稱重組體。連接方式有粘端連接和平端連接等多種形式。（1）粘端連接：用相同的限制性內切酶酶切目的基因和載體DNA分子，使之產生相同的粘性末端，在適當的溫度下，兩種DNA分子的粘性末端互補配對，再用DNA連接酶共價連接，成為完整的重組體。由于粘端連接具有很高的重組效率，在實驗中為首選方法。許多情況下，目的基因上找不到適當的與載體上相同的限制性酶切位點。此時可通過在目的基因兩端連上人工接頭(含適當限制性酶切位點的合成DNA小片段)，再經酶切后即可得到所需的粘性末端。（2）平端連接：在目的基因和載體分子上找不到匹配的限制性酶切點時，可采用平端連接法。少數酶酶切后能直接產生平末端，多數情況下先酶切產生粘性末端，再通過補平反應后成為帶平末端的分子。雖然平端連接有更廣的適應性，但重組效率遠不如粘端連接，陽性重組子篩選的難度也更大。
四、將重組DNA引入宿主細胞
現用原核宿主細胞以大腸桿菌(E·coli)為主。在基因工程中，由于重組DNA是體外制備的，將其轉入宿主細胞后，可能會受到宿主細胞限制酶的切割。因此宿主菌必須是無限制基因(或作用)的突變株(r—株)，如常用的E·coli株HB101，DH1等。一般將噬菌體DNA引入宿主細胞稱為轉染(transfection)，將質粒DNA引入宿主細胞稱為轉化(transformation)。
在導入重組DNA前，宿主菌用冷CaCl2溶液處理，使其細胞膜透性增加而成為感受態細胞，以利于重組DNA分子的進入。
五、篩選與鑒定重組體克隆
兩者相輔相成，互相驗證。陽性重組體的篩選可利用載體上的遺傳標志，包括抗藥性(采用無抗藥性的受體菌)、氨基酸合成酸系(用缺該酶系的異養型受體菌)和顏色反應(如α互補效應)等。另一種篩選方法是菌落雜交，將平皿上的轉化菌落轉印到硝酸纖維膜上，經堿處理使DNA變性，然后用目的基因的標記探針與之雜交，漂洗去多余的探針后進行放射性自顯影，根據顯影片上的斑點可判斷含有目的基因的菌落。重組DNA的鑒定有多種方法，如限制性酶切圖譜、DNA測序，Southern印跡雜交等，可根據情況酌情使用