基因克隆

外源DNA和質粒載體的連接反應 
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的５'磷酸和３'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是首選的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來。
　　ＤＮＡ一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反應中ＤＮＡ濃度低，則配對的兩個末端同一ＤＮＡ分子的機會較大（因為ＤＮＡ分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。這倦，在ＤＮＡ濃度低時，質粒ＤＮＡ重新環化將卓有成效。如果連接反應中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時，連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊)從理論上探討了ＤＮＡ濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決于兩個參數：j和i。j是ＤＮＡ分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈隨機卷曲。這樣，j與ＤＮＡ分子的長度成反比（因為ＤＮＡ越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對給定長度的ＤＮＡ分子來說是一個常數，與ＤＮＡ深度無關。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ長度，以cm計，b是隨機卷曲的ＤＮＡ區段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移，而后者可影響ＤＮＡ的剛度。
    i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對于具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里Ｎo是阿佛伽德羅常數，Ｍ是ＤＮＡ的摩爾濃度（單位：mol/L）。理論上，當j=i時，給定ＤＮＡ分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利于重新環化；當i>j，則有利于產生多聯體。圖1.9顯示了ＤＮＡ區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需ＤＮＡ濃度之間關系（Ｄugaiczyk等，1985）。 現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源ＤＮＡ片段。對于一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響， 而且還受質粒和外源ＤＮＡ末端的相對濃度的影響。當i是j的２－３倍（即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）外源ＤＮＡ末端濃度的２倍時，有效重組體的產量可達到最大。這些條什下，連接反應終產物的大約40％都是由單體質粒與外源ＤＮＡ所形成的嵌合體。當連接混合物中線瘃質粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源ＤＮＡ的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。


涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒ＤＮＡ的連接反應應包含：
１）足量的載體ＤＮＡ，以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體ＤＮＡ為20-60μg/ml。
２）未端濃度等于或稍高于載體ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ濃度比載體低得多，在效連接產物的數量會很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒ＤＮＡ或發跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。 
(二）粘端連接
１）用適當的限制酶消化質粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質粒ＤＮＡ。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
２）按如下所述設立連接反應混合物：
a．將0.1μl載體ＤＮＡ轉移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加溫５分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。
c．加入：10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液 １μl
Ｔ４噬菌體ＮＤＡ連接酶 0.1Weiss單位
５mmol/L ATP 1μl
于16℃溫育１－４小時
10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產品）（可用可不用）
該緩訓液應分裝成小份，貯存于－20℃。
    另外，再設立兩個對照反應，其中含有（１）只有質粒載體；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每個連接反應可用50-100ng質粒ＤＮＡ，并盡可能多加外源ＤＮＡ，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少３種不同方法來測定Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的活性。大多數制造廠商（除New England Biolabs公司外）現在都用Weiss等，１1968)對該酶進行標化。１個Weiss單位是指在37℃下20分釧內催化１mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時，１個Weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位（Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位（如Ｎew England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Ｗeiss單位的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶在16℃下30分鐘內可使50％的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶均為濃溶液（1-5單位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的Ｔ４噬體ＤＮＡ連接酶于-20℃保存３個月可保持穩定。
３）每個樣品各取１－２μl轉化大腸桿菌感受態細胞。 
（三）平端ＤＮＡ連接


高效感受態細胞制作
方法一
A液：1M，MnCl₂： 
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌； 
C液 稱取CaCl₂ 0.10g，KCl 1.18g，全部轉入細口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。 
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混勻冰浴即可使用。 
    劃線得到單菌落,37℃培養箱培養約17小時， 挑取2-4個形態飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養基的三角瓶,37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養3-4小時, 將培養溫度調至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養，其余與普通感受態差不多，每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280ml DMSO（可用國產分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。 
效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。 

    潔凈是最重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g 5min。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會減少衛星菌落出現。 

    預冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經常在室溫倒置1min，對感受態效率提高有幫助，第一次多加一點緩沖液，我經常加至20ml，效果不錯。

    關于大腸桿菌的感受態制備及轉化的方法很多，最復雜的莫過于電轉化，而最簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉化。對于做克隆工作的人而言，高而穩定的感受態可減輕不少麻煩。 
    現在大腸桿菌轉化效率最高的要數電轉化，可達到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉化效率，最好的莫過于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態的制備與轉化方法。 
    根據實驗室的實際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態效率的提高也有一定的幫助。 
1、所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。 
2、培養基的裝量：培養基的裝量是很重要的，這關系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態的。建議裝量不要高于此值為：培養基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培養基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個搖瓶結束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好，按要求做，肯定效率不低。 
4、培養后的OD值。其實這并一個非常重要的參數，只是當OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數生長已經不太可能，因此很多指導方法上強調OD不得大于0.6，0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，因而感受態絕對數量要大一點，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。 
5、培養基中的各種離子。經驗證明，當培養基中存在一定量的Mg2+離子時，該方法制得的感受態要相對較高。在制備普通感受時，使用20mM MgCl2做為培養基的添加物，在感受態收獲之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。 
6、培養溫度。文獻及經驗告訴我們，較低的溫度培養有利于感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了Inoue的高效感受態制備方法，它實際是利用了所有有利于感受態的文獻而得出的一個非常理想方法。 
7、此外文獻報道，在保存感受態時，DMSO要比甘油的效果要好，它會使感受態的效率增加。 
8、液氮速凍也會使感受態的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態，然后保存于超低溫冰箱內。至于在液氮中保存12小時以后再轉入超低溫冰箱，這點未做實驗，只是一種感覺，第一次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。