基因功能研究策略

隨著人類基因組計劃的順利進行,越來越多的新基因被發現,基因功能研究成為生命科學領域中的重大課題,目前基因功能研究方法主要有基因轉導、反義技術、轉基因和基因剔除、染色體轉導、RNA 干涉等。

一、 正常情況：

DNA→mRNA→蛋白質→功能（遺傳效應以及表型）

二、 基因功能研究策略：

1、 基因功能的獲得（gain-of-function）如：GFP轉基因鼠

Ⅰ、基因轉移（transgenic）：

①、 指外源基因導入受體細胞后能隨即整合到受體的染色體中，而相對穩定地表達,通過觀察細胞生物學行為的變化來認識基因的功能,是目前應用最多、技術最成熟的基因功能研究方法。

②、若受體細胞不具備該外源基因，則其獲得新的功能；若受體細胞具有該基因，則該基因在受體細胞內得到過渡的表達，即基因誘導超表達技術。

③、包括：

a、DNA介導的基因轉移:由于基因表達受轉導效率和是否持續穩定表達兩方面因素影響,因此需慎重選擇轉導系統。常用的基因轉導系統分為非病毒性表達系統和病毒性表達系統。

b、染色體介導的基因轉移（只用于少數情況）: 將大的DNA 片段克隆入酵母人工染色體、細菌人工染色體中可產生較好的表達水平和組織特異性,并可精確地調節同源重組。

Ⅱ、基因敲入（gene knock-in）: 基因打靶的一種方式，即通過基因打靶用一種基因替換另一種基因,以便確定它們是否具有相同功能。插入性載體：將正向選擇基因插入內源基因的功能區域造成插入突變。

2 、基因功能的缺失（lose-of-function）：如：KIT基因的突變

Ⅰ、基因敲除（gene knock-out）:基因打靶的另一種方式

①、基因敲除：

a、造成內源基因的敲除是利用DNA 同源重組(用含有已知序列的DNA 片段與受體細胞基因組序列相同或相近的基因發生同源重組) 原理進行的基因打靶最早也是最普遍的一種修飾內源基因的方式,通過敲除內源基因的功能片段,造成內源基因的結構或組成的突變,基因功能喪失,表現出特定的表型效應,可以反映該基因的功能。

b、置換型載體：造成內源基因一個功能片段被正向選擇基因置換,帶來缺失突變是進行基因敲除的常用方法。

c、利用基因敲除研究基因的功能已經成為基因組計劃中的非常重要的一個方面。

②、基因打靶（gene targeting）：外源的DNA片斷與同源的內源性序列定向重組（同源重組），導致遺傳信息的定向修飾。包括：1.基因滅活；2.點突變引入；3.缺失突變；4.外源基因定位引入；5.染色體重大片斷刪除。

Ⅱ、基因轉錄后沉默－RNAi（knock-down）:敲低表達效率

①、反義技術： 根據堿基互補原理,利用人工或生物合成的特異互補的DNA 或RNA 片段(或其修飾產物) 抑制或封閉目的基因的表達。包括反義寡核苷酸技術、反義RNA 技術和核技術

②、RNAi 是一種普遍的轉錄后基因沉默的機制,它是由一類外源性的RNA 分子—siRNA所引起的具有很強的關閉基因的功能,它能夠介導RNA干涉現象,

③、RNAi 技術就是通過人為地引入與靶基因具有同源序列的dsRNA ,從而誘導內源靶基因的mRNA 降解,達到阻止基因表達的目的。

3、 “dominant negative”策略：“dominant negative”策略是指利用基因工程技術獲得特定基因的“dominant negative”突變體,使其高表達,由于高表達的突變體的“dominant negative”作用而產生負面和不正常的效應,通過分析產生的負面或不正常的效應來推斷該基因的功能。

4、 轉基因動物：利用基因剔除(Gene knockout) 技術或轉基因技術獲得的模式生物可能是目前研究基因功能最具價值的手段。

5、 基因誘導超表達技術