本貼先講最簡單的一個點的定點突變技術，其它較長片段的突變，刪除，插入技術以后會慢慢奉上：
在做實驗之前，我們首先要搞清楚實驗的目的和實驗的原理。
實驗的目的應該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般情況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：
第一：我們吊出來的基因有點突變，相信這可能是大家經常會遇到的問題。基因好不容易吊出來，并裝進了自己的載體，卻發現有一兩個堿基跟自己的預期序列或所有的公共數據庫不匹配，然后暴昏。
大家實驗室里面還是用Taq酶為主吧，Pfu這樣的高保真酶大家應該用得不多吧，Taq酶的優點和缺點都很明顯：優點就是擴增效能強，缺點就是保真性差，其錯配機率是比較高的，相關數字忘了，大家可以去網上查那個數字，不過感覺如果是2000bp的基因，如果擴四五十個循環的話，很大機率會出現點突變，當然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關系，詳細情況這里就不討論了。
第二：要研究基因的功能，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實驗需要，相信這也是那些研究基因的人經常的一種思路吧。
對于第一種情況：我們首先要分析出現堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如說是三聯密碼子的最后一位，堿基的改變并沒有引起相應氨基酸的改變，那么一般情況下也可以不去理它。另外，在NCBI上人類的基因的版本一直在變化，也就是說同一個基因有不同的版本，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來的堿基序列與其中一個相匹配，一般也就可以不做定點突變了。如果有時間沒錢，那干脆重新PCR然后再克隆進自己的載體了，不過最好換個保真性好一點的酶如PFU，或者PCR循環數低一點，不過這些東西有時候也得靠運氣啦。實在不行的話再來做定點突變。
對于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點突變了。
接下來開始聊一聊定點突變的原理吧，那個Stratagene試劑盒！上面有一個說明書，說得好像很正規，不過上面好多都是什么ZL啊什么注意之類的話，看都不看，我們簡明扼要地只講實驗方面，通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產物，在PCR產物上就已經把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。
大家馬上就會想到幾個問題了：
第一：引物怎么設計呢？
第二：模板怎么去掉呢？
第三：怎么拿到質粒呢？
對于第一個問題：怎么設計引物？
我只能講一些原則，并舉一些例子。
引物設計的原則其它貼子上都有講，這里就不重復了：
不過這種突變引物要加上一個原則：
一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12base pair。
若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，大家應該都知道，引物至少要11-12個base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個base pair，并且合成多一條反向互補的引物。
這么說大家可能不是很清楚，那我就舉個例子吧：
X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
現有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
*********************************************** ************
|------>deletion
X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020
現有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
************************************************************
（上面為目的序列，下面為現有序列：我們發現有一個A堿基的缺失，其直接結果是在表達蛋白時后面的氨基酸全部錯配）
我們以它為中心設計引物：兩邊各至少12個堿基，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過低，故拉長引物使GC%含量不至過低，也使引物退火溫度升高。
故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
并合成反向互補引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
其實也不一定要反向互補序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個堿基，同時符合引物設計的原則就行了。
引物合成公司有很多家，大家可以去尋找，不同廠家的引物在價錢質量上有一些差別，不過價錢一般都是一塊多一個堿基，合成時間約為一周。
這樣的結果是PCR時把整個質粒都給擴出來了，得到的PCR產物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產物