一、限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）
1．定義：凡能識別和切割雙鏈DNA分子內特定核苷酸序列的酶，也稱為限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．類型：來自原核生物，有三種類型。
Ⅰ型：兼具甲基化修飾和ATP參與的核酸內切酶活性，隨機切割。
Ⅱ型：大多能特異識別4～6個核苷酸序列（回文結構），最大識別序列為8個核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10種Ⅱ型限制酶的識別序列為非回文結構，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作為基因工程的工具酶。另有一些來源不同的限制酶的識別位點是相同的核苷酸序列，將這類酶特稱為同工異源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工異源酶切割產生相同的末端；有一些同工異源酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感性有所差別，故可用來研究DNA甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成對的同工異源酶；其中HpaII和MspI是一對同工異源酶，其識別位點是CCGG。與同工異源酶對應的一類限制酶，它們雖然來源各異，識別序列也各不相同，但都產生出相同的粘性末端，稱為同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。顯而易見，由同尾酶所產生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來的，因此在基因克隆實驗中很有用處。但必須指出，由兩種同尾酶消化產生的粘性末端，重組之后所形成的序列結構再不能被原來的任何一種同尾酶所識別。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但為特定位點切割。
三種限制酶的區別如下表所示：
| Ⅰ型 | Ⅱ型 | Ⅲ型 | |
| DNA底物 | dsDNA | dsDNA | dsDNA |
| 輔助因子 | Mg2+,ATP,SAM | Mg2+ | Mg2+,ATP |
| 識別序列 | 特異 | 特異 | 特異 |
| 切割位點 | 非特定（于識別序列前后100~1000bp范圍之內） | 特定（切割于識別序列之中或近處，固定位點） | 特定（切割點在識別序列后25~75bp處） |
| 與甲基化作用的關系 | 內切酶蛋白同時具有甲基化酶的作用 | 酶蛋白不具有甲基化作用 | 內切酶蛋白同時具有甲基化酶的作用 |
3．命名：第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株。另外用羅馬數字代表同一菌株中不同限制酶的編號，現在常用來表示發現的先后次序。如HindⅢ是來自Haemophilus influenzae D（嗜血流感桿菌D株第三種限制酶）。
4．切割位點和結果：限制酶位點在DNA鏈上是隨機分布的，若識別位點為4bp，則44（256）個核苷酸可遇一個切點。若為6bp，則平均46（4096）個核苷酸才遇到一個切點。限制酶沿回文結構的對稱軸切開，則產生平頭末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多數限制酶錯位切開dsDNA，產生5′ or 3′-單鏈互補順序，稱為5′ or 3′-粘性末端（sticky or cohesive ends），如HindⅢ、PstI。
5．反應條件：
限制酶酶切反應的影響因素如下：
（1）DNA的純度
限制酶消化DNA的反應效率，在很大程度上取決于所使用的DNA本身的純度。提取DNA時，蛋白質、RNA、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高鹽等都有可能抑制限制酶的活性。小量制備的DNA尤其會遇到這種問題。RNA一般不影響酶的反應速度，但它能和蛋白質發生非特異性結合，從而減少酶的有效濃度。
少量蛋白質污染不影響酶活性，但如果是Dnase污染則會導致DNA的降解，它可能來源于溶解DNA的試劑溶液或者酶解緩沖液的組分。由于Dnase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的儲存緩沖液中含有二價金屬離子螯合劑EDTA，一般用1mmol/L
EDTA溶液（TE）溶解DNA，在保存DNA的過程中因為是低溫，Dnase不會有活性，一旦將DNA加入反應體系，EDTA的濃度降低，在37℃溫度下反應時，Dnase的活性就會發揮出來。混雜的結合蛋白則與DNA結合，不僅會封閉酶的識別序列影響酶解，而且形成的DNA—蛋白復合物將干擾DNA的電泳行為。要避免發生這種情況，唯一的辦法就是使用高純度的DNA。為了提高限制酶對低純度DNA的反應效率，一般采用如下4種措施。