實驗材料 麥穗
試劑、試劑盒 植物凝膠乙醇次氯酸鈉蒸餾水亞精胺
儀器、耗材 EP 管移液槍
實驗步驟
1. 組織培養基的準備
( 1 ) 首先準備所需濃度 2 倍的植物凝膠，高壓滅菌（見注 2 ) 。
( 2 ) 所有的組織培養基都要過濾滅菌，因此除了無菌的儲備液，其他培養基成分按所需濃度 2 倍的量混勻，調到合適的 pH 后過濾滅菌（使用瓶頂過濾器、0.22 μm 微孔濾膜）。
( 3 ) 使用前將 2x 凝膠和 2x 培養基在水浴鍋中加熱至 60℃。
( 4 ) 將所需儲備液在無菌條件下加入到熱的培養基中，培養基和植物凝膠混合后倒入 9 cm 培養皿中（Sterilin)。
( 5 ) 分化培養時，使用高培養皿（100 mmx 20 mm，Falcon) 。
( 6 ) 滲透處理時，使用 5 cm 小培養皿 （Sterilin) 。
2. 幼胚的分離
(1) 幼穗的采收與消毒
① 當幼胚直徑長到 1~2 mm 時米收麥穗（見注 3) 。
② 在取麥穗之前，從每一穗中間取一粒種子，查看幼胚的大小，確保達到所需的要求 [ 可參考第 9 章「農桿菌介導的大麥轉化方法」，圖 9.2 (a ) ~（c ) ] 。
③ 將種子從穗子上取下來，去芒，但不要破壞種殼。
④ 先用 70% 的乙醇沖洗 30s，再用蒸餾水沖洗 3 遍，然后在次氯酸鈉（Fluka 71696) 與水比例為 50：50 的溶液中浸泡 4 min，再用蒸餾水沖洗 4 遍 ，最后將水倒掉但保持種子濕潤，置于無菌的螺口瓶中待用。
(2) 分離幼胚摘除胚軸
所有的操作均在超凈臺中進行：
① 每次大約取 20 粒無菌種子，置于解剖鏡無菌的藍色或黑色底板上，用一只鑷子固定種子，另一只懾子剝出幼胚，去除胚軸（見注 4) 。
( 2 ) 每皿愈傷誘導培養基放 25~30 枚幼胚，盾片朝上，25℃ 暗培養。
3. 制備 DNA 包裹的金粉微粒
(1) 制備金粉母液
DNA 包裹金粉微粒的方法與文獻 [ 9 ] 中的方法相似
① 稱 40 mg 金粉于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 100% 乙醇。
② 渦旋振蕩使金粉充分混勻，離心使其沉淀。
③ 倒掉乙醇，重復步驟 2 兩次。
④ 最后一次離心后，去除乙醇，加入 1 ml 無菌水渦旋振蕩使之重懸。
⑤ 將金粉以 50 μl 分裝于無菌的 EP 管中，分裝時注意不斷混合以保持金粉顆粒處于懸浮狀態，分裝后保存在 -20°C 。
(2) 亞精胺制備
① 將裝有 1 g 亞精胺（Sigma- Aldrich) 的瓶子置于 65°C 水浴鍋中加熱使之融化。
② 用移液槍取 14 μl 溶液分裝于無菌的 1.5 ml 離心管中，-20℃ 儲存待用。
(3) 金粉微粒的包裹
① 從冰箱中取出亞精胺，并使其解凍。
② 加入 986 μl 無菌水，渦旋振蕩混合。
③ 用 1 ml 過濾器和小的過濾器濾頭（Minisart 0.2 μm 過濾器，Sartorius) 將溶液過濾到無菌的 1.5 ml 離心管中，制成 0.1 mol/L 亞精胺溶液。
④ 從冰箱中取出一管 50 μl 的金粉并使之解凍。
⑤ 沿裝有金粉的離心管管壁，加入 5 μl DNA ( 1 μg/μl) ，立即渦旋振蕩使金粉和 DNA 充分混合（見注 5) 。
⑥ 然后將 50 μl 2.5 mol/L CaCl2 和 20 μl 0.1 mol/L 亞精胺加入到離心管管蓋中，蓋好蓋子，顛倒離心管使 CaCl2 和亞精胺與金粉顆粒混合（顛倒離心管之前不能讓 CaCl2 和亞精胺與金粉顆粒混合），立刻渦旋振蕩使所有組分充分混合。
⑦ 管子在冰上放置 1 min，然后于 1957 g 離心不超過 30 s，使金粉沉淀。
⑧ 去除上清液，加入 250 μl 100% 乙醇，用槍頭輕輕吹打混勻，然后渦旋振蕩，這個過程是洗滌包埋了 DNA 的金粉微粒。
⑨ 1957 g 離心不超過 30 s 沉淀金粉微粒，去除上清，加入 60 μl 100% 乙醇。
⑩ 渦旋振蕩重懸金粉顆粒。DNA 包埋的金粉微粒即微載體已制備完畢。