基因槍活體植物基因轉染

本實驗所用基因傳遞系統（基因槍）原理：

低壓基因遞送系統（GDS-80 基因槍 U.S. Patent Number: 6,436,709 B1），根據火箭噴嘴原理和空氣動力學原理設計，是用于傳遞生物微粒進入靶細胞的一種新型系統。如圖1中所示，當左側出現輸入氣體壓力時（如：氦氣），兩個腔室之間將形成巨大的壓力差，一旦該氣體穿過裝載樣品的咽喉處，GDS-80 中的氣體輸出將為生物粒子提供足夠的動能量，使它們加速到接近超音速的速度（約 300m/s）。在加速過程中，樣品溶液會霧化并均勻地噴灑到靶向目標的表面上。

影響轉染效率的因素：

在執行 GDS-80 轟擊的同時，有四個主要因素影響轉染效率。涉及火箭噴嘴設計原理方面，有兩個：傳遞壓力的設定和槍管的直徑。通過增加輸送壓力的設定，可以使兩個腔室中的壓力差變大，從而增加生物微粒的速度，增加動能；而增大槍管直徑會降低微粒的輸出速度。傳遞距離也在實驗中起到重要的作用，通過增加從槍管到目標樣品的傳遞距離，生物顆粒將受空氣阻力影響而減慢速度，不過這樣也同時降低了損壞靶細胞的幾率。最后一個因素是傳送樣品的總量，被傳送的樣品量越大，越夠能提高轉染效率。 然而，調整輸送距離和傳遞壓力是幾個因素中最重要的，槍管大小和輸送樣品量應該保持在一個恒定數值，這樣更容易修正實驗。

活體植物實驗：

針對植物細胞的基因組研究，現在已經通過使用很多不同的策略而被廣泛開展。無論這些研究的主要目的是什么，這些研究成果終究是需要應用于活體植物的研究中來。將基因轉染到活體植物方面之前存在很多障礙，比如如何維持無微生物的環境，如何保護植物本身組織的脆弱性，如何設定傳遞壓力的大小，甚至是植物處于什么生長狀況都是需要考慮的方面。通過使用 GDS-80 系統，Wealtec 公司為基因轉染活體植物這項實驗提供了最便捷的方法。

通過調節傳遞壓力和距離，GDS-80 可將生物微粒成功轉染到活體植物的植物細胞中。

材料:

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• 煙草葉和藜屬植物

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• 低壓基因遞送系統：GDS-80 （Wealtec）

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• 通用目標間隔器，UTS-10 （Wealtec）

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• 質粒 DNA：以綠色熒光蛋白（GFP）報告性基因構建的病毒 DNA。

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• MaestroTM 活體成像系統。 （CRI 公司）

操作步驟：

1. 在進行實驗前，至少培養樣品 30 天，這樣確能保葉片大于 5×6 cm2。

2. 根據以下步驟制備 DNA-金粉混合液：
a. 將金粉微粒中加入充足的無菌蒸餾水。
b. 使用 100％ 乙醇對金粉微粒進行三次洗滌并棄去浮層。
c. 加蒸餾水使金粉微粒重新懸浮。
d. 將準備好的 DNA 溶液（1μg/μl）添加到金粉微粒溶液中，形成濃度為 1 μg DNA / 0.6 mg 金粉微粒懸濁液。
e. 劇烈搖晃微離心管使得樣品混合均勻。
f. 滴入適當體積的 0.1M 亞精胺和 2.5M CaCl2 進入試管，同時不斷劇烈地搖晃。
g. 繼續搖晃一分鐘以上。
h. 用 100％EtOH 進行三次洗滌，并棄去浮層。
i. 重新使DNA包裹的金粒子懸浮于100% 的 EtOH 中。

3. 按照說明書中要求的，講 UTS-10 安裝到 GDS-80 系統上，并設置 40-50 psi 的傳遞壓力。

4. 調整距離量尺至 6-8 cm 的傳遞距離。

5. 把四爪葉片夾夾到目標葉上，用手調螺栓將其擰緊固定。

6. 將等分10μl DNA混勻懸濁液倒入樣品裝載孔中。

7. 對葉片標本進行轟擊。

8. 培育植株三天以上，通過使用 CRi MaestroTM 的體內成像系統觀察熒光結果。


（A）煙草植物葉片


(B)藜屬植物葉片

圖 1. 葉子被轟擊后培育 3 天。通過使用 CRi Maestro TM 活體成像系統，左側照片使用真彩色圖像拍攝，右側照片使用熒光感光拍攝。



（C）煙草植物葉片

圖2. 經過 7 天培育后，與被轟擊過的葉子同屬一顆煙草植株上的另一片葉子。通過使用 CRi Maestro TM 活體成像系統，左側照片使用真彩色圖像拍攝，右側照片使用熒光感光拍攝。

討論：

活體植物的性狀特征和組織構成在不同植物間是有區別的。而在轟擊活體植物過程中，有很多關于該特定種類植株的情況需要被考慮到，如植物所處生長階段、植物大小、組織損傷，以及轟擊部位。當傳遞生物微粒進入植物細胞時，操作者需要基于植物組織的性狀而調節傳遞條件。在這篇文章中，藜葉的結構比煙草葉結構更復雜。當向藜葉傳遞時，最好要縮短 1-2cm 的傳遞距離或增加傳遞壓力，以獲得更好的結果。圖2中，藜葉使用距離 6 cm/50 psi 傳遞，煙草葉通過 UTS-10 配件輔助使用距離 8cm/40 psi 傳遞。 然而，在縮短與藜葉距離后，煙草葉子上的轉染效率依然比較高。無論什么時候，組織都不應在轟擊后而受到損傷導致枯萎，這是調節傳遞條件時應首先遵循的原則。

經過 7 天的培養，由于 DNA 質粒中構建了具有GFP報告性基因的病毒 DNA，因此 GFP 基因能夠遍及整個植株表達和擴展。在圖中 3 中可以看到，被轟擊植株上的不同葉子，通過毛細管束被 GFP 基因感染。如果培養的時間周期較長，該基因可在整個植株中傳遞。 

通過調節壓力和距離這兩方面來控制傳遞條件是非常容易實現的。 GDS-80 是一款非常強大的工具，尤其用來傳遞基因到活體植物中。通過 UTS-10 配件的輔助，無論是在體內還是在體外進行的實驗，用戶都可以更輕松地完成他們的植物靶向實驗。