目前DNA測序儀的工作原理主要基于Sanger發明的雙脫氧鏈末端終止法或Maxam-Gilbert發明的化學降解法。這兩種方法在原理上雖然不同，但都是根據在某一固定的位點開始核苷酸鏈的延伸，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生以A、T、C、G為末端的四組不同長度的一系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行片段的分離和檢測，從而獲得DNA序列。由于雙脫氧鏈末端終止法更簡便和更適合于光學自動探測，因此在單純以測定DNA序列為目的的全自動DNA測序儀中應用廣泛。而化學降解法在研究DNA的二級結構以及蛋白質-DNA相互作用中具有重要的應用價值。這里主要介紹雙脫氧鏈末端終止法的測序原理 。
雙脫氧鏈末端終止法測序是利用DNA的體外合成過程-聚合酶鏈反應，在DNA聚合酶的催化作用下，以目的DNA為模板，按照堿基互補配對原則，在引物的引導下完成。