基因測序技術發展史

　　在我心中，近100年生物技術最大的突破就是測序技術，正是由于測序技術的不斷進步才使得人類可以破解生命的密碼。但是一直以來由于成本較高加之技術復雜，大多數檢測實驗室始終無法將測序作為常規檢測方法。近年來來隨著納米孔測序的興起，使得大多數實驗室使用測序作為常規檢測的時代不再遙遠！本文將從檢測的角度來闡述測序技術。

　　一、一代測序（Sanger法測序）

　　一代測序技術指的是由1975年Frederick Sanger發明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain Termination Method）。基于第一代測序技術的測序儀幾乎都是采用該方法。其核心原理是采用ddNTP取代dNTP，在合成核酸鏈的過程中ddNTP無法形成磷酸二酯鍵，從而導致DNA合成反應中斷。對每個ddNTP進行熒光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后通過毛細管電泳進行分離，通過檢測熒光信號獲得DNA序列。

　　 一代測序特點：

　　準確度：測序的金標準，準確度高于二代和三代測序；

　　測序長度：單端700-1000bp，比二代長，比三代短；

　　測序成本：低；

　　測序通量：一個反應只能得到一條序列，測序通量低；

　　PCR：由于測序是基于PCR產物，因此會出現非特異擴增和高GC片段擴增效率低等問題。

　　數據分析：要求低，多序列比對軟件即可。

　　Sanger法測序是目前實驗室使用最廣泛的測序技術，常用來對臨床檢測為陽性的樣品，進行測序進一步獲得序列信息，進而進行基因分型。很難完成大基因組測序。

　　二、二代測序

　　（高通量測序(High-Throughput Sequencing, HTS）；

　　新一代測序 (Next Generation Sequencing, NGS) ）

　　其特點是一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，目前主流的二代測序平臺有3種，分別為：Illumina公司的Hiseq平臺；Themo fisher公司的Ion Torrent平臺和華大基因MGISEQ 平臺，另外還有2016年退出市場Roche公司的454這里就不介紹了。

　　Illumina公司的Hiseq平臺

　　首先通過不同的方法將打碎的DNA碎片末端連接序列已知的接頭，構建單鏈DNA測序文庫。將測序文庫的每一條單鏈DNA通過特異性的接頭固定在一個固體支撐體上，固體支撐體的每一個單獨小空間中只包含一條DNA鏈，之后通過PCR特異性的將模板DNA進行富集，從而達到測序所需的模板量。反應過程中加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，用激光掃描反應板表面，根據dNTP多帶的熒光讀取每條模板序列每一輪反應所聚合的核苷酸種類，經過“合成-清洗-拍照”的循環過程，最終得到目的片段的堿基排列順序。Illumina測序是通過熒光信號和拍照的方式來識別核苷酸的序列。

　　Themo fisher公司的IonTorrent平臺

　　所采用的技術為半導體測序，通過半導體芯片直接將化學信號轉換為數字信號。自然情況下，DNA聚合酶將一個核苷酸滲入到DNA分子中就會釋放出一個H+，導致局部可檢驗的PH值發生變化。如果發生結合，就會釋放H+,相應的溶液PH值會發生改變，被離子傳感器檢測到，從而轉換為數字信號。

　　該方法比Illumina平臺測序速度更快但是數據量小于Illumina。

華大MGISEQ平臺

　　基因組DNA首先經過片段化處理，再加上接頭序列，并環化形成單鏈環狀DNA，隨后使用的滾環擴增技術（Rollingcircle amplification, RCA）可將單鏈環狀DNA擴增2-3個數量級，所產生的擴增產物稱為DNA納米球（DNAnanoball, DNB），最終納米球經過DNB裝載技術固定在陣列化的硅芯片上。DNA分子錨和熒光探針在DNB上進行聚合，隨后高分辨率成像系統對光信號進行采集，光信號經過數字化處理后即可獲得待測序列。目前該平臺資料較少，是我國的驕傲！

　　二代測序特點：

　　準確度：單條可達99.9%準確度，高于三代測序，低于一代測序；

　　測序長度：單端100-150bp，比二代和三代短；

　　測序成本：單次測序成本中等，單個堿基測序成本最低；

　　測序通量：可達數百萬條以上片段，幾十G-幾T的數據量；

　　PCR：由于建庫中利用了PCR擴增，會產生PCR的偏好性和一定概率的堿基錯配。

　　數據分析：要求高，需要專業的生物信息學分析工具。

　　二代測序在前幾年資本市場的推動下風生水起，涌現了一大批上市公司，因此服務體系完善，產品成熟。從檢測的角度，二代測序可用于宏基因組的檢測，遺傳病和腫瘤基因的檢測。

　　三、三代測序（單分子測序）

　　在2011年和2014年，PacBio和Oxford Nanopore Technologies，ONT公司分別發布了新型的單分子測序技術平臺，這種突破性的測序技術被成為第三代測序技術。與前兩代測序技術相比，其最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增，并且理論上可以測定無限長度的核酸序列。

　　PacBio平臺

　　每個ZMW (零模波導孔)只允許一條DNA模板進入，DNA模板進入后，DNA聚合酶與模板結合，加入4種不同顏色熒光標記4種dNTP，其通過布朗運動隨機進入檢測區域并與聚合酶結合從而延伸模板，與模板匹配的堿基生成化學鍵的時間遠遠長于其他堿基停留的時間，因此統計熒光信號存在時間的長短，可區分匹配的堿基與游離堿基。通過統計4種熒光信號與時間的關系，即可測定DNA模板序列。

　　ONT平臺

　　將在某一面上含有一對電極的特殊脂質雙分子層置于一個微孔之上，該雙分子層中含有很多的納米孔，并且每個納米孔會結合一個核酸外切酶。當DNA模板進入孔道時，孔道中的核酸外切酶會“抓住”DNA分子，順序剪切掉穿過納米孔道的DNA堿基，每一個堿基通過納米孔時都會產生一個阻斷，根據阻斷電流的變化就能檢測出相應堿基的種類，最終得出DNA分子的序列。

　　三代測序特點：

　　準確度：單條序列的準確率約85%，拼接后可達99%，準確度低于二代測序和一代測序；

　　測序長度：單端幾百bp-幾M，長度最長；

　　測序成本：目前比二代和一代測序成本高；

　　測序通量：可達數百萬條以上片段，幾十G-幾T的數據量；

　　PCR：無需PCR，直接測序。

　　數據分析：要求高，需要專業的生物信息學分析工具。

　　其他：可進行RNA直接測序，Nanopore的minion測序儀可以做到隨身攜帶。

　　Nanopore的Minion便攜式測序儀是第一款普通實驗室都可以配置的測序儀，也使得測序技術可以真正廣泛應用于臨床檢測。

　　由于三代測序的高錯誤率和長度長特征，目前最適合應用于臨床樣品的宏基因組檢測。