基因測序技術大升級

  DNA就像是漆黑的夜里螢火蟲發的光，第二代測序技術無法辨別每一只螢火蟲，所以就把上千只螢火蟲放在同一個袋子里，才能收集到它們的光。但第三代技術卻可以辨別每一只螢火蟲，而且可以同時測量很多個DNA片斷。

日前，南方科技大學生物系副教授賀建奎與另外幾名中美科學家聯合在生物醫學雜志BioRxiv上發表論文，展示了使用深圳瀚海基因GenoCare第三代單分子熒光測序儀完成的大腸桿菌基因組測序結果，準確率達到99.7%。

這是第三代基因測序中準確率最高的。賀建奎在接受《中國科學報》記者采訪時自豪地說。

基因測序技術的前世今生

單分子熒光測序技術被譽為第三代基因測序技術。若要明白其高明之處，不妨先了解一下前兩代基因測序技術。

基因是生物體內一道道蘊含機密的密碼，蘊藏了生物絕大部分遺傳信息，人類自發現了基因就無一日不想破解它的秘密。基因測序就是要測定未知的序列，確定重組基因的方向與結構，對突變進行定位和鑒定比較的研究。

第一代基因測序技術誕生于1977 年，是由美國生物化學家A.M.Maxam和W.Gilbert發明的化學降解法。這種方法僅從化學領域觸發，科學家將一個DNA 片段的5 端磷酸基作放射性標記，再分別采用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產生一系列長度不一而 5 端被標記的DNA片段。然后再通過凝膠電泳分離，經放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的基因的堿基序列。

同年，英國生物化學家Frederick Sanger發明了雙脫氧末端終止法，即至今廣泛應用的Sanger測序法。應用這一技術，科學家完成了首次的人類全基因的測序工作。Sanger測序法是用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過聚合酶的引物延伸產生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。以該法為基礎，Sanger后來對它進行了許多改進，使之更適合實際操作，為后來的大規模測序提供了技術支持，其中一個重要改進是利用單鏈DNA噬菌體載體將隨機打斷的DNA片斷分別測序，再拼成完整的基因。

上世紀90年代初出現的熒光自動測序技術逐步代替了雙脫氧末端終止法，并且將DNA測序帶入自動化測序時代。

第二代測序技術較之第一代，進步主要體現在高通量與低成本上。第一代測序技術一次只能測一個基因，第二代測序技術則一次可以測量幾萬個基因。賀建奎解釋說。2012年11月，大型國際科研合作項目千人基因組計劃的研究人員發布了1092個人的基因組數據。參與這一項目的科學家用第二代測序技術完成了對世界上主要人群的基因組測序工作，繪制了迄今為止最詳盡、最有醫學應用價值的人類基因組遺傳多態性圖譜。然而，讀長相對較短仍是第二代測序技術的主要瓶頸。

為了突破這一瓶頸，科學家們繼續探索，終于發現了單分子的測序技術。這一技術也被稱為第三代測序技術。與前兩代不同的是，它基于單分子水平的邊合成邊測序。賀建奎解釋說，第三代的單分子熒光技術多條基因并行的測序方法與第二代相同，但第三代實現了單分子納米級別的測量。打個比方，DNA就像是漆黑的夜里螢火蟲發的光，第二代測序技術無法辨別每一只螢火蟲，所以就把上千只螢火蟲放在同一個袋子里，才能收集到它們的光。但第三代技術卻可以辨別每一只螢火蟲，而且可以同時測量很多個DNA片斷。

節約時間和金錢

第三代測序技術真正實現了對每一條DNA分子的單獨測序，有著更快的數據讀取速度，應用潛能也勢必超越先前的測序技術。第三代測序技術包括單分子熒光測序技術、單分子實時測序技術和納米孔測序技術。

單分子熒光測序技術與賀建奎有著千絲萬縷的聯系，我導師的導師朱棣文，是單分子光學檢測的鼻祖，1997年諾貝爾獎得主。我們將先進的光學技術用到了測序工作中。”賀建奎介紹道。

更重要的是，因為單分子級別的分辨率極高，省略了以往測序工作中聚合酶鏈式反應（PCR）的步驟。PCR是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加，就像放大鏡。但放大DNA也需要時間，省略這一步驟意味著時間的節約。

第三代測序技術最大的優勢還是在于時間與金錢的節約。”賀建奎介紹道。第一代DNA測序技術2001年完成首個人類基因組圖譜，耗時3年，花費數十億美元；二代測序技術將一個人基因組測序的時間和費用降為1周以內和1000美元；而他們的三代測序儀可在24小時內完成這一工作，在大規模量產后，有望在三年內將費用降至100美元。

在使用時，人們只需要提供唾液、毛發、血液等含有生命物質的物品，放入試劑盒，即可以看到結果。賀建奎說，而且，測序之前的樣品制備不需要單獨準備，而是由這臺測試儀一并解決。

更令賀建奎驕傲的是，深圳瀚海基因GenoCare第三代單分子熒光測序儀的成功問世，源于各個領域的合作。“這些領域包括精密機械、先進光學、納米材料、分析化學、分子生物學，甚至還有流體力學以及軟件工程。賀建奎感慨道，這需要多個學科共同努力、深度交叉，甚至在以后也要依靠各個學科共同推進，才能有測序儀新的突破。

走向臨床應用

賀建奎與同事們研發的深圳瀚海基因GenoCare第三代單分子熒光測序儀，雖不是首個技術應用，但它卻是站在巨人的肩膀之上，向著臨床應用的方向不斷前進。

與另一家公司美國螺旋生物（Helicos）當年生產的第三代單分子熒光測序儀相比，瀚海基因樣機的尺寸只有其1/4大小，單臺造價僅為Helicos測序儀當年造價的1/6，并且瀚海基因成功實現了所有化學試劑消耗品的國產化。而且，我們的基因測序儀不再需要PCR儀、凝膠成像儀、熒光定量PCR等多個輔助儀器，而是全部集成在一臺機器中。賀建奎說，更重要的是，在全球第三代測序儀中，南科大研發的GenoCare基因測序儀通量和準確度兩個方面都達到世界領先。在30x測序深度下其準確率達99.9%。