基因測序的步驟

PCR產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用于基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多態性研究、基因組重疊序列群等.與傳統克隆測序技術相比較,直接對PCR擴增的DNA進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳統的細菌培養,模板提取等重復性操作,可以從少量的原始樣品中得到正確的DNA序列信息.PCR產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點.
試驗試劑
PCR擴增的雙鏈DNA模板
長約20個核苷酸的DNA引物
DNA聚合酶
測序膠
0.1mol/L DDT
α-32P-dATP
dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)
dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)
測序反應緩沖液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl
終止緩沖液：95% 甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚藍,0.05% 二甲苯腈
試驗步驟：
1、 4個微量離心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC溫浴5min,備用.
2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的PCR擴增雙鏈DNA,10pmol測序引物,2μl 5×測序緩沖液,加雙蒸水至總體積10μl,96OC加熱8min,冰浴泠卻1min,4OC 10000g離心10s.
3、 加入2μl預冷的標記混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,測序酶2U,加水至15μl,混勻后置冰上2min,標記新合成的DNA鏈.
4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物,37OC溫浴5min.每管各加入4μl終止液.
5、 樣品在80OC的水浴中熱變性5min,每一泳道加2μl 加到測序膠上,電泳分離這些片段.
注意事項：
1.?PCR產物要有一定的長度(>200bp),因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的準確性較低.
2.?純化PCR產物可通過離子交換層析使擴增的DNA段與反應剩余的dNTP及引物分離；也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將PCR產物與非特異性擴增產物和引物分離開來；如果擴增的特異性較高時,可直接通過酚：氯仿抽提,乙醇沉淀的方法來純化.
3.?測序引物設計原則類似于PCR引物設計,可在DNA合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物,經過高壓液相層析或聚丙烯酰胺凝膠電泳純化后,即可用作測序引物.
PCR循環測序法
PCR循環測序法是將PCR擴增和核酸序列分析技術相結合,從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法,也稱作線性擴增測序.該方法采用PCR儀加熱使DNA模板變性,在TaqDNA聚合酶作用下,以溫度循環模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應,線性擴增標記的DNA分子.
PCR循環測序法與以往的測序方法相比,其優點在于：大大減少所需的模板量；能提高測序反應產生的信號,降低了操作的復雜性,且聚合酶的用量減少；可在小量制備的模板上進行篩選反應；高溫下進行的測序反應使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域；雙鏈閉環DNA可以直接作為反應模板應用,不用作預先堿變性處理.由于PCR循環測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列,因此, PCR循環測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視.
試驗試劑：
DNA測序試劑盒
dNTP
ddNTP
丙烯酰胺
雙丙烯酰胺
尿素
TEMED(N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺)
過硫酸銨
6%測序膠：6%丙烯酰胺,7mmol/L 尿素,1×TBE.
10×測序緩沖液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明膠,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP
終止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L)
終止緩沖液：95%甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈
試驗步驟
1、 4個小離心管,每個小管加入3μl的終止混合液,將管子放在冰上.
2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×測序緩沖液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加雙蒸水到30μl徹底混勻,每管7μl加入上面4個小管中.
3、 反應液上加30μl的石蠟油.
4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30個循環,可根據具體的情況進行適當的調整循環條件及循環次數.
5、 反應結束后在油層下加入5μl的終止緩沖液并用加樣槍混勻.
6、 上樣前將樣品在大于80OC的水浴中熱變性5min,每一道加2μl加到測序膠上,電泳分離這些片段.
注意事項：
1、 制備測序模板：PCR 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收后,用于序列分析；可經過柱層析純化,去除PCR 反應后剩余的dNTP和引物后,用于序列分析.PCR 產物也可不經純化直接用于測序,但是這種測序產生的結果較差,建議測序之前應進行PCR產物的純化.各種標準的質粒制備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用.用標準方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用.但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列,否則將會導致測序實驗的失敗.
2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5‘端進行標記,反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈.引物的濃度不宜高,否則容易形成引物二聚體,或產生非特異性的擴增引物.
3、 酶：各種缺乏3‘—5‘端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用于循環測序,其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中最為常用.雖然應用PCR循環測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定,但仍未能適應大規模DNA序列測定的需要,而PCR循環測序法、熒光標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術.該技術是采用熒光標記引物或雙脫氧核苷三磷酸,反應產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后,經特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測的DNA序列.它的應用減輕了DNA序列測定的工作量,提高了測序的效率.