基因篩查進入單細胞時代

　　遺傳篩選是生物學中最有力的工具，它可以闡明復雜的生物過程。最近四項研究已經開發了一個新的遺傳分析方法，通過使用單個細胞作為微觀實驗室，測定擾動。這些研究開發了CROP-seq、PERTURB-seq和CRISP-seq技術，克服了現有基因篩查方法的局限性，并且可以分析一些原本無法分析的樣本。

　　目前，若要將遺傳擾動與細胞表型相關聯，人們主要使用兩種策略——芯片篩查和混合篩查，但兩種方法都各有缺點。芯片篩查中，細胞接種于微孔板中，每個微孔中引入單個擾動，并基于成像、轉錄或蛋白質的測量，提供每個孔中細胞的高分辨率表型。然而，芯片篩查受到高成本和勞動力和/或機器人的可用性的限制。并且每次篩查，需要的細胞數量較多，因此通常只能分析可在培養皿中增殖的細胞。相比之下，混合篩查允許在單個細胞樣本中快速篩查數千個并行擾動。在混合篩查中，擾動通過與單個特定表型（例如細胞存活）相關聯來排序。不同于芯片篩查，混合篩查不會顯示每個擾動的詳細表型；并且可靠的篩查標志物還有待開發。由于假陽性率高，混合篩查結果通常還需要二次篩查來驗證。

　　CROP-seq、CRISP-seq和Perturb-seq技術結合了兩種篩查策略的優勢，代表的是功能基因組學的根本轉變。類似于混合篩查，這些新方法使用CRISPR-Cas9系統在單個樣本中并行生成多達數千個遺傳擾動，但使用單細胞RNA-seq（single cell RNA-seq， scRNA-seq）作為讀數。該方法可以同時測量每個細胞的擾動和表型（圖1）。這些新技術不依賴于特定表型或存活，表型被記錄為整個轉錄組，為解剖基因功能關系提供了驚人的數據。基于板的scRNA-seq平臺還可以為每個細胞進行附加測量，如成像或FACS數據。所有這些新方法都成功地將豐富的表型信息與細胞平板中的每個特定擾動相關聯，有助于實現大規模基因組功能篩查。為了解讀這些技術得到的數據，每個研究小組開發了線性回歸模型，由Dixit等人進一步形式化。

　　將CRISPR篩選融入scRNA-seq，在技術上并不容易。CRISPR驅動的擾動需要從RNA聚合酶III（Pol III）特異性U6啟動子處，表達高水平的靶向特定基因的單向導RNA（single guide RNA， sgRNA）。但是sgRNA缺少poly（A）尾端，所以其身份不能通過標準scRNA-seq方法讀出。所有這三種方法通過產生攜帶pol III：sgRNA和Pol II驅動的可選擇和/或熒光標記的載體來解決這個讀出問題，其中3'UTR含有sgRNA特異性序列。PERTURB-seq和CRISP-seq依賴于芯片克隆策略產生的RNA庫，來將每個sgRNA鏈接到特定的擾動條形碼轉錄物上。相比之下，CROP-seq的克隆解決方案更為簡單優雅：將Pol III：sgRNA復合體整合到報告轉錄物中，并插入到慢病毒載體的長重復序列末端中。這樣Pol III：sgRNA復合體在病毒整合期間會被復制。這種簡化的克隆方法使得CROP-seq與現有的CRISPR篩查sgRNA庫融合在一起。

　　這些論文提出的方法無需生物標志物，可用于檢測之前無法進行的檢測（如混合檢測、復雜細胞群體中的擾動檢測，以及無法培育增殖的稀有細胞的篩查）。所有研究表明，這些方法可以很容易地識別單個細胞中的多個擾動。Datlinger等人、Dixit等人和Adamson等人的研究證明了這些方法可用于檢測單一細胞類型或同系培養細胞的擾動。Jaitin等人證明，擾動也可以在更復雜的場景中進行，包括活的小鼠體內。該實驗特別令人印象深刻，他們從GFP-Cas9小鼠中取得造血祖細胞，用sgRNA載體的混合物轉入向導RNA，并注射到次級受體小鼠中。在成功植入后，這些小鼠被免疫攻擊，研究者取出脾細胞，并且使用CRISP-seq檢測每個擾動的影響——受刺激的細胞偏向于分化成某些骨髓細胞的程度或改變激活程序，對刺激物產生響應。

　　這些平臺的一個特別的優點是完整的轉錄組測序提供了“一刀切”的測定法，可同時捕獲多種表型，而不依賴生物標志物。這些測定還利用CRISPR-Cas9系統的模塊化和靈活性。CRISPR-Cas9系統不僅可以用于基因敲除，還能用于基因沉默和基因激活。Adamson等人使用靶向多達18，905個基因的向導RNA庫，證明了CRISPRi的可靠性和可擴展性。Dixit等人分析了超過20萬個細胞，證明了單細胞轉錄組學的可擴展性。相反，將來的技術可能直接對一小份活檢樣本中的幾萬個細胞進行混合篩查。

　　當然，這些方法也不乏局限性。也許最根本的是，信息表型很大程度上限于細胞自主過程，而許多過程，如干細胞分化，則依賴細胞信號傳導。剖析非自主過程仍然需要使用大規模篩查。另一個限問題是需要確定每個細胞中每個基因是否被成功敲除。因為技術報告指出sgRNA存在，但不能直接顯示這些sgRNA是否確實發揮了作用。然而，如Adamson等人所證明的，通過分析轉錄讀數可以部分解決這個問題。另一個實際的問題是成本。雖然增加每個細胞的測序深度通常可以克服scRNA-seq數據的固有噪聲，但是為了節約成本，就只能減少檢測的細胞數目。Datlinger等人和Jaitin等人結論分別是，大約30個細胞和50-100個細胞就足以捕獲每個擾動表型。盡管有這些局限性，但是CROP-seq、CRISP-seq和PERTURB-seq的簡單性以及它們帶來的新應用在未來幾年將大有可為。