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  • 發布時間:2019-03-26 15:29 原文鏈接: 基因組文庫的擴增實驗

    通過平板培養可對重組噬菌體文庫進行擴增,平板培養的原種可直接來源于本方案所述的包裝混合物。但只要可能,該擴增過程可被省略,而感興趣的 DNA 序列可從原始文庫直接篩選。擴增將不可避免地降低文庫的復雜性,部分原因在于在連續幾輪的噬菌體生長中,對生長緩慢的重組噬菌體來說是十分不利的。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。


    實驗方法原理通過平板培養可對重組噬菌體文庫進行擴增,平板培養的原種可直接來源于本方案所述的包裝混合物。但只要可能,該擴增過程可被省略,而感興趣的 DNA 序列可從原始文庫直接篩選。擴增將不可避免地降低文庫的復雜性,部分原因在于在連續幾輪的噬菌體生長中,對生長緩慢的重組噬菌體來說是十分不利的。
    實驗材料

    λ 噬菌體文庫大腸桿菌鋪平扳細菌

    試劑、試劑盒

    氯仿SM

    儀器、耗材

    LB 或 NZCYM 瓊脂平板Sorvall SS-34 或相當型號加熱設備或水浴

    實驗步驟

    一、材料

    1. 緩沖液和溶液

    氯仿

    SM

    2. 培養基

    LB 或 NZCYM 瓊脂平板(150 mm)

    LB 或 NZCYM 頂層瓊脂糖

    3. 離心機和轉子

    Sorvall SS-34 或相當型號

    4. 專用設備

    預置于 47℃ 的加熱設備或水浴(用于頂層瓊脂糖)

    5. 載體和菌株

    λ 噬菌體文庫

    大腸桿菌鋪平扳細菌

    二、方法

    1. 為了擴增 λ 噬菌體文庫,將含 10000~20000 個重組噬菌體的 50 μl 或更少體積的多個包裝混合物組分與 0.2 ml 鋪平板細菌在 13X100 mm 試管中混勻,37℃ 溫育 20 min。

    2. 加 6.5 ml 已熔化的 47℃ 的瓊脂或瓊脂糖至感染細胞的第一個試管中,通過輕拍或溫和地渦旋振蕩混勻,立即倒入新鮮灌制的 150 mm 平板內的底層瓊脂上。對余下的感染細胞重復該過程。

    3. 將平板于 37℃ 最長放置 8~10 h。

    4. 將平板中加入 12 ml SM ( 如果用烤盤,則加 150 ml), 4℃ 水平放置過夜。

    5. 將所有平板中的 SM 都收集至一個單獨的無菌聚丙烯離心管或瓶子中。每個平板再加 4 ml SM 進行沖洗,與最初回收的 SM 液合并。加入 0.2 ml 氯仿至回收的擴增噬菌體培養物中,室溫放置 15 min,并偶爾輕輕搖晃使氯仿裂解所有的感染細胞。

    6. 4℃ 4000 g ( 5800 r/min 在 Sorvall SS-34 中)離心 5 min,去掉細胞和瓊脂糖碎片。

    7. 將上清轉移至新的無菌試管或瓶子中。將擴增噬菌體文庫分成數個組分,4℃ 保存。用噬菌斑分析測定文庫滴度。


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