基因編輯進展梳理PartII基于CRISPRCas9的技術應用篇(二)

5. 優化堿基編輯器實現細胞、類器官和小鼠中的高效編輯

2018年7月，Nature biotechnology刊登了一篇新的研究，通過密碼子優化和加入額外的核定位序列，重新設計BE3、BE4Gam和xBE3的序列。優化篩選的組成型和誘導型堿基編輯系統極大地提高了C to T的突變效率，重新設計的堿基編輯器還能在多種小鼠和人類細胞系以及腸道器官中進行目標修飾，該研究還在成年小鼠肝臟中成功介導了有效的體內細胞編輯。這些優化有助于單堿基編輯工具更加高效靈活的應用[13]。

6. eA3A-BE3：工程化人源APOBEC3A減少目標位點的周邊突變

2018年 7月，哈佛大學和麻省總醫院的J. Keith Joung課題組在Nature biotechnology發文，通過使用一種工程化的人APOBEC3A (eA3A )結構域來減少基于CRISPR - Cas9的胞苷脫氨酶周邊突變的策略，該結構域根據一種TCR>TCY>VCN的優先等級來對特定基序中的胞苷進行去氨基化，極大地降低了普遍存在的五堿基對編輯窗口中存在不止一個C時，現有的堿基編輯器會產生不必要的C到 T轉換的可能。eA3A-BE3比BE3顯示更高的精度（超過40倍）以及更低的脫靶效率，且保持相似的編輯活性。利用這一系統他們還高效校正了人β-地中海貧血啟動子的突變，為堿基編輯的臨床運用提供了更高精度的編輯工具[14]。

7. hA3A-BE3:：人APOBEC3A實現高甲基化區域C to T的高效編輯

2018年8月，來自上海科技大學和中科院的研究人員在Nature biotechnology發文，通過篩選多種APOBEC和 AID脫氨酶，發現人類APOBEC3A結合BEs的系統具有更窄的編輯窗口可以在甲基化水平和GpC二核苷酸含量高的區域高效介導C到T的堿基編輯，解決了目前基于大鼠APOBEC1的BEs 系統在編輯高度甲基化的胞嘧啶時效率相對較低的問題[15]。



8. 同期兩篇報道首次利用ABEs系統實現老鼠疾病模型的構建

2018年9月，Protein & Cell期刊刊登了兩篇利用優化改良腺嘌呤堿基編輯器（ABE）分別在小鼠和大鼠中進行高效的堿基編輯。文中不僅強調了ABEs在誘導A - T轉化為G - C過程中的保真度和效率，還展示了它們在產生疾病模型以及糾正動物和人類胚胎中的疾病突變方面的潛在易用性和多功能性。具體如下：

l 華東師范大學生命科學學院院長、邦耀生物首席科學家劉明耀教授及團隊成員李大力教授課題組，使用優化的ABE系統有效地創建了三種小鼠品系，成功構建了遺傳性肌肉變性疾病（DMD）的小鼠模型。另外同時構建了II型遺傳性糖原貯積病（GSD）的大鼠模型。這是第一個通過堿基編輯系統在老鼠上實現高效點突變的報道。該研究不僅在疾病模型的構建方面有很大的潛力，更重要的是在治療由點突變引起的遺傳性疾病方面具有重要應用價值[16]。

l 中山大學黃軍就和松陽洲團隊同樣適用ABEs系統測試了在疾病小鼠模型構建中的有效性。通過ABE來靶向mRNA剪接位點以誘導基因功能障礙的策略成功構建了小鼠白化病和DMD模型。這些結果表明ABEs可以有效和精確地將小鼠胚胎中的堿基A轉化為G，證明這是一種產生點突變小鼠模型的高保真工具[17]。

9. A3A-PBE：利用nCas9和人類APOBEC3A的融合，在植物中進行高效的C to T編輯

2018年10月，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組在Nature Biotechnology上發文，展示了一種由Cas9 nickase和人APOBEC3A （A3A-PBE）組成的堿基編輯系統（A3A-PBE）在小麥、水稻和馬鈴薯中高效地C到T的堿基編輯。同時將尿嘧啶糖基化酶抑制劑 (UGI)和MU融合到A3A-PBE，創建了A3A-Gam系統，極大地提高了堿基編輯效率。新系統不僅將基于大鼠APOBEC1的BE3僅限5 nt序列編輯窗口擴大到了17nt，而且還能有效地編輯GC含量高的區域，對于新品種培育和作物遺傳改良具有重要的應用價值[18]。



小結

綜上，為大家簡單介紹了2018年CRISPR系統在大動物模型構建和單堿基編輯技術上的重大突破。展望未來，我們可以預見CRISPR-Cas9技術將會給基礎科研和臨床研究帶來的突飛猛進的發展。盡管現階段還沒有充分開發，但這項技術已經在生物以及醫療研究中帶來了革命性的變革，包括基因組編輯、基因篩選和細胞示蹤，疾病治療等等。關于更多重大應用我們下期繼續介紹！

參考文獻：
[1] http://www.sciencemag.org/news/2017/11/human-has-been-injected-gene-editing-tools-cure-his-disabling-disease-here-s-what-you.
[2] Yan, Sen, et al. "A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington’s Disease." Cell (2018): S009286741830285X.
[3] Liu, Zhen, et al. "Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer." Cell (2018):S0092867418300576.
[4] Peiyuan Qiu, et al. "BMAL1 knockout macaque monkeys display reduced sleep and psychiatric disorders."National Science Review (2019): https://doi.org/10.1093/nsr/nwz002.
[5] Zhen Liu, et al. " Cloning of a gene-edited macaque monkey by somatic cell nuclear transfer." National Science Review (2019): https://doi.org/10.1093/nsr/nwz003.
[6] Yao, Xuan, et al. "Generation of knock-in cynomolgus monkey via CRISPR/Cas9 editing." Cell Research (2018).
[7] Cui, Yiqiang, et al. "Generation of a precise Oct4-hrGFP knockin cynomolgus monkey model via CRISPR/Cas9-assisted homologous recombination." Cell Research 28.3 (2018).
[8] Weiqi, Zhang, et al. "SIRT6 deficiency results in developmental retardation in cynomolgus monkeys." Nature (2018).
[9] Hu, Johnny H., et al. "Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity." Nature.
[10] Li, X. et al. Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol190 36, 324-327 (2018)
[11] Koblan, Luke W, et al. "Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction." Nature Biotechnology (2018).
[12] Wen, Jiang, et al. "BE-PLUS: a new base editing tool with broadened editing window and enhanced fidelity." Cell Research (2018).
[13] Paz, Zafra Maria, et al. "Optimized base editors enable efficient editing in cells, organoids and mice." Nature Biotechnology (2018).
[14] Gehrke, Jason M, et al. "An APOBEC3A-Cas9 base editor with minimized bystander and off-target activities." Nature Biotechnology (2018).
[15] Xiao, Wang, et al. "Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion." Nature Biotechnology (2018).
[16] Yang, Lei, et al. "Increasing targeting scope of adenosine base editors in mouse and rat embryos through fusion of TadA deaminase with Cas9 variants." Protein & Cell 9.9 (2018).
[17] Liang, Puping, et al. "Effective and precise adenine base editing in mouse zygotes." Protein & Cell 9.9 (2018).
[18] Zong Y, et al.  Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A.Nature Biotechnology (2018).