基因的重組連接技術

DNA酶切片段的連接是分子生物學實驗中又一關鍵技術，該技術是基因重組，基因改造的重要中間環節。兩DNA片段相鄰的5'磷酸和3'羥基間可由連接酶催化形成磷酸二酯鍵，這個連接反應在體外一般都有大腸桿菌DNA聯接酶和T4DNA聯接酶催化，但分子生物學實驗中主要采用T4DNA聯接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應。在分子生物學實驗中連接酶主要用于1)基因重組中載體與外源基因的連接；2) 接頭與DNA片斷的連接，這種連接一般發生在文庫構建、分子標記的AFLP及差異表達的研究等中。連接反應可在溶液中進行也可在瓊脂塊中進行。本課程中在AFLP、文庫構建、PCR片斷的克隆等中均有連接的內容，在本部分僅以重組克隆為目的介紹相應的連接類型。在基因重組克隆中外源DNA與載體的連接是承上啟下的一步操作，根據連接片斷末端類型不同，連接方式有粘端連接、平端連接等和平粘端連接及單堿基配對的T－載體連接。其中粘端連接的效率最高，粘端連接與平粘連接中外源DNA片斷在載體中的插入有方向性。平端連接的效率最低，且載體發生自連的比例較高，因此在克隆操作中為了克服平連的弊端，通常可通過1)TdT酶在載體和外源DNA片斷上轉移一互補序列（核苷酸投影法）；2)在載體和外源DNA片斷上加上人工接頭，變平連為粘連。下面擬通過T4DNA聯接酶對酶切片段的連接操作，使學員掌握這一DNA片段的連接操作技術。

A：溶液中連接

一：儀器離心機、恒溫設備、真空干燥機、取液器

二：試劑

T4DNA聯接酶

10×T4DNA聯接酶緩沖液

200mM Tris-HCL (pH 7.6)、50mM MgCL2、5mM ATP、50mM DTT

500μg/ml ／牛血清白蛋白(可不用)

λDNA/HindIII 酚/氯仿、 酚、氯仿、TE緩沖液、電泳緩沖液、3M NaAC(pH 5.2)

三:操作：

1:取干凈、滅菌Ephondof管，安下表加入各試液

T4DNA聯接酶緩沖液 1ul

載體DNA片斷 1ng

插入目的片斷 Xng

連接酶 1u(平末端,如為粘端連接,則酶量可小于1u)

加無菌水到 10ul

X=目的片斷與載體片斷的分子比例×載體ng數×目的片斷的堿基數/載體ng數

（目的片斷/載體片斷的分子比例一般為3/1）
2:連接反應

22℃保溫3小時或4℃過夜(Promega連接酶,粘端連接)

或22-26℃1hr(BRL連接酶,粘端連接)

或22℃4-16hr(Promega連接酶,平端連接)

或14℃16-24hr(BRL連接酶)

B：膠內連接：
該方法是一種快速克隆技術，將要重組連接的外源DNA片斷用低熔點瓊脂糖分離，在紫外燈下切下待克隆片斷，溶化后加入緩沖液、載體DNA、連接酶直接連接。這種連接的待克隆片斷既可以為酶切基因組片斷也可為PCR片斷，既可平連也可粘連，但連接效率較溶液中連接要低的多，但這種連接省去了待克隆片斷的回收純化操作。這種連接方法要求目的DNA量、載體量及酶量都要增加。

一：儀器：同A

二：試劑：同A

三：操作

1：低熔點瓊脂糖膠分離外源DNA片斷，在紫外燈下切下目的片斷

2：65℃保溫徹底溶化瓊脂，取18ul（約0.1-0.5ug）于一新管內再加入2ul載體（約0.01-0.05ug）混勻，37℃5－10min

3：配制2×T4DNA連接酶反應體系20ul，（其中含2×T4DNA連接酶緩沖液和不低于2uT4DNA連接酶）混勻，點動離心后置于冰浴

4：將預冷的2×T4DNA聯接酶反應體系20ul加到“2”中含待連接DNA樣品管中立即混勻后立即置于冰浴中待凝固

5：置于12℃連接過夜。

6：此連接片斷可直接用于轉化，即轉化前65℃溶化，取5－10ul轉化。

注1：粘端連接時模板DNA用量控制在0.1-0.5ug間，而平連時模板量應>0.5ug。拈連時溫度可在4℃過夜，而平連時最好在12－16℃過夜

2：用于轉化的連接片斷最好不要冰凍

3：膠內連接時，應用TAE緩沖液，而不應用含TBE的膠，因硼酸能與瓊脂糖中的方式糖單體或多聚體結合成難溶復合物，這種復合物使膠難熔解，將抑制連接酶。

4：在紫外光下觀察切割條帶時,操作要快，DNA條帶在紫外光下的暴露時間應盡量短，因UV會引起DNA變異。