原代細胞培養:取5kg左右兔空氣栓塞法處死后斷頭,于無菌條件下從枕大孔處用大止血箝扳開顱骨暴露并小心取出腦組織放入裝有DMEM的培養皿中,用眼科鑷分離基底動脈后按常規平滑肌方法貼塊培養。
傳代:
(1)吸除培養瓶內舊培養液。
(2)D-Hanks液沖洗2遍。
(3)加入消化液少許,以能覆蓋瓶底為限。
(4)倒置顯微鏡觀察發現細胞胞質回縮、細胞間隙增大時,立即終止消化。
(5)吸除消化液,向瓶底注入D-Hanks液數毫升,輕輕轉動培養瓶,把殘留消化液沖掉。
(6)用吸管吸取培養液輕輕反復吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液;首次傳代將原代細胞按1:1傳代,此后按1:3進行傳代。
(7)傳代后細胞放置在37℃,5%CO2孵育箱內培養。
我在做細胞培養時的一些小經驗:
(1)在超凈臺操作(廢液杠放入)前要用紫外燈照30MIN以上,75%酒精擦手
(2)貼塊法要細胞貼壁好一定剪的夠碎(先把血管剪成小段再狂剪一頓),鋪開時要平均的展開,聚在一起翻面時容易沖掉。
(3)做原代的時候從取材直到放進孵箱都要嚴格無菌操作,該換的管子還是換了,別省了根管子壞了一瓶細胞
(4)原代培養FBS含量最好高些,原代很嬌貴的。