三、微生物分類和鑒定
在感染性疾病治療過程中，特別是臨床樣本中的病院微生物鑒定，臨床微生物學實驗室是臨床醫生的重要合作伙伴，細菌種類的鑒定可以指導抗生素的合理選擇。在藥物敏感性實驗協助下，臨床醫生可以確定哪些抗生素是有效的、哪些抗生素可以成功控制感染。采用MALDI-TOF MS技術可以實現不同培養條件下分離的廣譜臨床微生物的高效和精準的鑒定。因此，對抗菌素治療來說，一種快速而準確的抗菌鑒定方法是非常關鍵的。
3.1、培養皿中微生物鑒定
MALDI-TOF-MS在微生物鑒定中的臨床應用主要來自于培養皿。使用
這種方法，在幾分鐘內，用小量的微生物生物量（104-105細菌）可以對一大群不同細菌種類進行鑒定。用消毒的接種針從瓊脂培養皿中人工挑選菌落，然后涂抹在一個不銹鋼的MALDI靶板上，靶板上有高度規則的便于均勻加樣的精細結構。樣品干燥，添加少量基質，如HCCA，與MALDI靶板上的細菌樣品共結晶，然后將樣本放入質譜儀進行分析檢測。
綜合比較性研究評估了MALDI-TOF MS的重現性和準確性。2001年，研究者比較了MALDI-TOF質譜儀和傳統生化法對細菌的鑒定，結果顯示99.1%的樣本兩種方法結果高度一致。另一項研究顯示，MALDI-TOF MS鑒定凝固酶陰性葡萄球菌的總體正確率打到93.2%。2011年，研究顯示MALDI-TOF MS對不同種類的葡萄球菌鑒定結果可靠（準確率達到99.3%），認為與基于rpoB的測序鑒定的標準方法相同。2012年，研究報道MALDI-TOF MS檢測涵蓋革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的296例菌株，其屬（39屬）和種（102種）的正確鑒定率分別為94.9%和83.4%。另一研究提示，與其他系統相比，MALDI-TOF MS是彎曲菌及其相關細菌鑒定首選。評價革蘭氏陰性細菌的鑒定，2263種臨床有意義的菌種可以采用MALDI-TOF MS鑒定出。Faron等研究顯示MALDI-TOF MS鑒定多中心分離的的菌株屬的正確率為99.8%（2258/2263）,種的正確率為98.2%（2222/2263）。
綜上所述，MALDI-TOF MS被認為是一種適合于從培養皿中高通量微生物鑒定的十分準確的方法。
3.2 、陽性血培養微生物鑒定
MALDI-TOF MS可以直接對血培養中分離的細菌進行鑒定。研究顯示，MALDI0-TOF MS檢測584例陽性樣本，有562例檢測出存在一種細菌。使用MALDI Biotyper的另一項研究結果顯示，在181個單以微生物培養物中，屬和種的陽性鑒定率為97.8%。然而，也有一些大的問題存在，當血培養中有多重細菌菌種時，只能鑒定一種細菌，從而出現錯誤。此外，它不允許用于某些特殊類型微生物的鑒定，包括草綠色鏈球菌和有莢膜的微生物，如克雷伯菌肺炎球菌和流感嗜血桿菌。如果直接分析血培養基，則人血中的成分可能干擾檢測或者產生雜峰，因此，將血培養基進行預處理對降低干擾、濃縮細菌非常重要。為了解決這些問題，研發了MBT Sepsityper?試劑盒。一項有關Sepsityper?試劑盒研究顯示，比革蘭氏陽性微生物（100%菌屬和67.7%菌種）更多的革蘭氏陰性微生物（100%菌屬，91.4%菌種）被準確鑒定。另外，研究報道了MALDI-TOF MS對厭氧菌、α溶血性鏈球菌和多種微生物情況的鑒定有難度。Arroyo等研究顯示，采用MALDI-TOF MS 直接對單一微生物生長陽性的血培養中分離的200株革蘭氏陰性桿菌進行鑒定，其屬和種的鑒定率分別為94%（188/200）,91%（181/200）。此外，Chien等研究證實MALDI-TOF質譜法成功直接對405例顯示陽性的血培養中的細菌和真菌進行鑒定。其中對365例單一微生物生長的血培養分別有89.6%和72.1%正確鑒定到種和屬水平，剩下的40例多種微生物生長的血培養，分別有82.5%（33/40）和92.5%（37/40）正確鑒定到種和屬水平。而對于患者來源的血培養，則采用MALDI-TOF MS進行鑒定分析時，需要對樣本進行預處理以除去非細菌蛋白。當采用MALDI-TOF MS進行血培養鑒定時，從血培養報警培養陽性到鑒定出微生物結果只需要半小時，且80%的血培養陽性標本可以得到一個可靠的鑒定結果。對于傳統的血培養鑒定流程，陽性血培養樣本需要根據不同的微生物種或者屬，在瓊脂板上分離培養過夜或更長時間。當得到菌液后，再用生化方法進行進一步鑒定。而質譜則可以直接使用1毫升的血液培養陽性肉湯，無需通過細菌培養，直接花大概30分鐘進行樣本制備，然后采用MALDI-TOF-MS進行檢測。與傳統生化鑒定方法相比，MALDI-TOF MS鑒定血培養陽性樣本，可以節省生化反應時間24-48小時或者更長。目前醫學實驗室用戶可以買到CE-IVD認證的樣品制備試劑盒和軟件。
3.3、患者尿標本直接微生物鑒定
尿路感染，包括膀胱炎（膀胱/下尿路感染）和腎盂腎炎（腎/上尿路感染）是最常見的臨床細菌感染的類型。對于急性和復查的尿路感染，及時診斷治療十分重要。因此，減少微生物鑒定所需的時間非常重要，可以通過直接用尿液樣本進行檢測。一項研究結果表明，利用4ml尿樣進行低速離心去除白細胞，然后以高速離心收集細菌，細菌沉淀洗滌后，直接滴加到MALDI-TOF MS靶板，91.8%的微生物種和92.7%微生物屬可以被鑒定。另一項研究顯示，MALDI-TOF MS可以可靠地對尿液樣本中細菌CFU/ml低到103的樣本進行直接鑒定。這些結果表明，MALDI-TOF MS是一種準確的尿細菌鑒定方法，在未來可以更廣泛的應用。
3.4、分枝桿菌的鑒定
分枝桿菌是一種在全球范圍內造成嚴重的公共衛生問題的主要的病原體類型。分枝桿菌屬于放線菌屬，包括190多種。結合分枝桿菌是引起人類致死性最多的病原菌。幾年來，由于自身免疫性疾病和免疫力低下患者增加，非結核分枝桿菌感染引起的疾病大大增加。
結核分枝桿菌診斷的金標準是從人類分泌物中，比如痰液、支氣管肺泡灌洗液或胸膜液中分離培養出細菌，并通過涂片顯微鏡檢查確認。但是分枝桿菌的種類的鑒定具有很大的挑戰性，因為結核培養和生化鑒定每一步時間都很長（7至21天甚至更長）。另外的診斷工具，包括痰涂片抗酸桿菌，都不如培養敏感。因此，為了改進患者的預后，分枝桿菌的鑒定需要更快、更準確的方法。近期，結果最近，測序和探測方法已經用于細菌鑒定，核酸雜交（NAH）或核酸擴增檢測有助于疑似肺結核患者中屬于結核分枝桿菌復合物群（MTC）的病原菌鑒定。
研究顯示，與核酸雜交方法相比，MALDI-TOF MS可以100%正確鑒定結核分枝桿菌，核酸雜交只能對38.5%的非結核分枝桿菌進行鑒定。菌株[41]。已經證實，在臨床實驗室，MALDI-TOF MS對結核分枝桿菌復合物群（MTC）鑒定有很高的靈敏度，且可以縮短鑒定時間，成本低。盡管MALDI-TOF MS對對結核分枝桿菌復合物群（MTC）的鑒定最經濟快速，由于非結核分枝桿菌在臨床上越來越重要，采用MALDI-TOF MS對肺結核分枝桿菌感染還需要進一步研究。有文獻推薦方法可以減少MALDI-TOF MS鑒定鳥型分枝桿菌（MAC）的錯誤發生。另外，一些極為相關的菌種間由于有相類似的質譜圖，不能用MALDI-TOF MS進行分離鑒定。例如，嵌合體分枝桿菌和胞內分枝桿菌兩者就很難分辯。由于不同細菌亞型顯示不同的抗生素耐藥性，細菌的精準、快速鑒定對正確使用抗生素十分有用。研究表明，MALDI-TOF MS可以分別對87.3%（89/102）和62.8%（64/102）在固體培養基培養陽性的結核分枝桿菌菌株準確鑒定到屬和種水平。
3.5、酵母和真菌的鑒定
酵母菌和真菌感染是免疫抑制患者常見的并發癥，因此與自身免疫性疾病、血液腫瘤、造血細胞移植和器官移植密切相關。侵襲性念珠菌病是一種常見病中心靜脈導管相關感染，侵襲性肺曲霉菌病可導至肺炎、發熱、胸膜炎胸痛和咯血癥狀。由于傳統的酵母和真菌鑒定成本高、費時，近來MALDI-TOF-MS應用于酵母和真菌的常規鑒定被推薦。例如，研究顯示，MALDI-TOF-MS在2683例臨床酵母菌株中鑒定出41類特殊菌種，酵母菌株的正確鑒定率達到98.8%（2651/2683）。因此認為，與目前的基于DNA鑒定的金標方法相比，MALDI-TOF MS是經濟、簡單。
對于絲狀真菌，研究顯示，MALDI-TOF MS在種的水平對菌株鑒定正確率可以達到95.4%；與生化方法比較，MALDI-TOF MS用于鑒定絲狀真菌更加準確。與傳統生化鑒定方法相比，MALDI-TOF MS更簡單、快速、便宜、更精確，可以用來區分十分接近的真菌種類。未來持續增加真菌文庫對維持其鑒定的穩定可靠性十分必要。
四、抗生素耐藥性檢測
MALDI-TOF MS微生物鑒定技術常用于臨床微生物學實驗室。此外MALDI-TOF MS還可用于抗菌敏感性試驗（AST）。許多科學家設計了用MALDI-TOF質譜分析AST的多種方法，本文主要詳細介紹其中三種方法包。
4.1、抗生素降解檢測
這種方法主要用于檢測β-內酰胺酶抗生素耐藥。對β-內酰胺酶抗生素的耐藥性主要是由于β-內酰胺酶表達，β-內酰胺酶水解β-內酰胺環，從而使抗生素失活。通過β-內酰胺酶水解β-內酰胺環相當于加了一個水分子，這個反應導至18Da質量變化，采用MALDI-TOF MS非常容易檢測到這個質量變化。采用臨床分離的大腸桿菌模型菌株來開發方法。模型菌株用多種不同類型的β-內酰胺類抗生素處理，然后檢測菌種來確定各菌株的抗生素明感性結果。研究顯示，MALDI-TOF-MS可檢測由碳青霉烯酶產生的碳青霉烯類化合物水解產物，說明MALDI-TOF-MS具有快速檢測β-內酰胺抗生素耐藥性的潛力。該方法也被用于直接檢測血培養陽性樣本碳青霉烯酶活性。這樣能夠更快決定抗生素治療方案，加快感染控制措施的落實。研究顯示，在某種情況下，當β-內酰胺酶活性太低或者酶的表達延遲時，MALDI-TOF MS檢測結果可能為假陰性，需要將孵育時間延長到4小時以避免錯誤的產生。
4.2 檢測抗生素耐藥菌株的特殊標志物
用采用MALDI-TOF WCMS（全細胞質譜）進行微生物鑒定相同的樣本處理方法來進行抗生素耐藥菌株的生物標志物檢測。用cfiA陽性脆弱類桿菌菌株中可以檢測到一些特定的信號，cfiA由B類金屬-內酰胺酶編碼，使脆弱雙歧桿菌對所有的β-內酰胺類抗生素耐藥，包括碳青霉烯類。幾乎100%耐碳青霉烯類桿菌的cfiA均呈陽性。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是全球大多數國家的公共衛生與醫院衛生的關鍵問題。能夠快速鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是醫療領域的一個重大改進。許多研究表明在在三個SCCmec基因盒的位置編碼的一個PSM-mec小的肽段可以顯示一個2415m/z處的信號，這個信號與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌高度相關。葡萄球菌耐甲氧西林有三個不同機制，37%耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有2415m/z處的信號。盡管該信號敏感性比較低，但特異性很高，達到》98%。這表明不經過任何其他的樣本處理，這個峰對臨床是有價值的。
4.3、細菌表型耐藥性分析
這種方法類似于微生物抗生素耐藥性的表型觀察。這個方法的好處是它比傳統技術更快，因為只需培養2-3小時。原則上，它可以用來通過優化在抗生素存在下微生物生長而檢測抗生素耐藥性機制。當微生物與抗生素一起孵育時，細菌生長在含有同位素標記的氨基酸的培養基中。只有具有耐藥性的微生物才可以生長而引入標記的氨基酸。通過帶有標記的、重的氨基酸的耐藥菌珠新合成蛋白質呈現與敏感和耐藥菌株不同的質譜圖。將耐藥菌株質譜圖與標準菌株相比較，可以在數小時內確定細菌的耐藥性。
五、通過MALDI-TOF MS肽/蛋白質譜
進行細菌的分型
傳統的生化細菌鑒定僅提供種的結果。MALDI-TOF MS可用于獲得菌株的蛋白質圖譜。利用蛋白質圖譜，可以有機會檢測到與表型相關的生物標志物，如耐藥菌株或類似物種的鑒定。細菌分型的方案是在細菌完成鑒定后，通過采用相同的細菌蛋白譜獲得細菌分型信息。這個方法可以用于對耐藥菌株的鑒定或者用于菌種復合體的精確鑒定。
臨床前抗生素耐藥菌株檢測可用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株。大多數cfiA陽性的脆弱類桿菌是碳青霉烯耐受性的。blaKPC陽性相關信號與產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌碳青霉烯類耐藥株高度相關。菌種復合體的準確鑒定可以用于在基因和蛋白質譜水平顯示僅有輕微差異的單核細胞增生李斯特菌群（包括單核細胞增生李斯特菌、李斯特菌伊萬諾維等）。
六、MALDI-TOF質譜鑒定微生物的局限性
目前MALDI-TOF-MS不適于鑒別志賀氏菌、大腸桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎桿菌等。陰溝腸桿菌復合體是一群具有相似耐藥圖譜，目前還不能分辯的的六個非常密切相關的菌種。此外，肺炎球菌、草綠色鏈球菌和有莢膜的微生物，如肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌可能采用MALDI-TOF MS鑒定時會被錯誤鑒定。大多數這些細菌菌株可以通過采用參考譜來進行鑒定，但是，還有很一個小部分具有非常相似的遺傳背景或者菌種間廣泛多樣性的菌珠不能通過質譜信號進行區分，繼而獲得可靠的鑒定結果。而且MALDI-TOF-MS鑒定絲狀真菌的主要局限性在于參考譜。菌譜信息庫的持續更新和樣本恰當的富集方法是將增加在MALDI-TOF MS在微生物鑒定中的作用和應用潛力。
七、結 論